传染性法氏囊病病毒蛋白功能的研究进展

（浙江大学农业部动物病毒学重点实验室，杭州 310058）

孙晓媛，王三应，周继勇，廖 敏

·综述·

传染性法氏囊病病毒蛋白功能的研究进展

（浙江大学农业部动物病毒学重点实验室，杭州 310058）

传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）是引起急性、高度接触性鸡传染性法氏囊病（infectious bursal disease，IBD）的病原体。该病毒感染引起的高传染性和免疫抑制给养禽业带来巨大的经济损失，3周龄以下鸡群感染是导致免疫抑制和免疫缺陷时诱发二次感染和对其他病原免疫失败的重要原因。IBDV的研究得到越来越多的重视，对IBDV编码蛋白功能的认识有助于深入了解IBDV的致病机制，也为IBD的防控提供了重要依据。

传染性法氏囊病病毒；蛋白；研究进展

孙晓媛，王三应，周继勇，廖 敏

传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）是双RNA病毒科，禽双RNA病毒属中的成员。它具有两个血清型（血清I 型和血清II型），鸡源性为IBDV血清I 型，血清I型根据其毒力可分为经典毒株（classical IBDV，cIBDV）、疫苗毒株（attenuated IBDV）、变异毒株（variation IBDV，vIBDV）和超强毒株（very virulent IBDV，vvIBDV）；血清II型是从有鼻炎和腹泻症状的火鸡体内分离得到，感染血清II型病毒的鸡不产生临床症状和显著的损伤。1986年，Hudson等[1]首次扩增获得了IBDV的全基因组序列，IBDV成为双RNA病毒科中第一个被测序的病毒。

IBDV基因组分为A和B两个节段（见图1）。A片段（大约3260 bp）主要包括2个部分重叠的开放阅读框（open reading frame，ORF），其中大的ORF编码相对分子质量约110 kDa的多聚蛋白前体（pVP2-VP4-VP3），由1012个氨基酸组成，可自动加工成为成熟的VP2前体pVP2（54 kDa）、VP3（32 kDa）以及非结构蛋白VP4（28 kDa）， pVP2（1～512）蛋白在VP4蛋白水解酶的作用下，被进一步加工成成熟的VP2蛋白（1～441）和4个小肽：pep46、pep7a、pep7b和pep11；小的ORF编码17 kDa的非结构蛋白VP5。B片段（大约2827 bp）只有1个开放阅读框ORF，主要编码分子量约为90 kDa的VP1蛋白。它是一种RNA依赖的RNA聚合酶，以游离蛋白或基因组连接蛋白两种形式存在（VPg），共价结合在RNA的5'端。IBDV基因组A、B片段的5'-NCR中都包含一个32 bp的保守序列，而3'-NCR的末端都含有一个GCGGU组成的五聚体；A片段的3'端和B片段的5'端都有反向毗邻重复区，可形成茎环结构，此二级结构与病毒的复制、表达以及包装有关。

下面对5种蛋白功能的研究进展进行阐述。

1 VP1蛋白

VP1是成熟IBDV中分子量最大的蛋白，但含量却很低，仅占总蛋白的3%～4%，是一种RNA依赖的RNA聚合酶（RNA～dependent RNA polymerase，RdRp），也是病毒复制的必需蛋白，具有鸟苷酸转移酶和甲基转移酶活性。VP1蛋白通过丝氨酸-5′GMP磷酸二酯键与dsRNA正链的5'末端共价结合参与到病毒基因组RNA的复制。Pan等[1]研究发现VP1蛋白只有与rGMP共价结合时才具有自身鸟苷酸化活性，自身鸟苷酸化过程不需要RNA模板的参与，但依赖于二价金属离子的存在，同时D402A和E421Y聚合酶活性关键性氨基酸位点的突变可以使VP1失去RNA合成活性，其自身鸟苷酸化活性却不受影响，表明VP1自身鸟苷酸化活性位点与聚合酶活性位点不属于同一位点。

此外，VP1在病毒基因组RNA合成、复制和mRNA的合成及病毒核酸的包囊中起到重要作用。VP1与VP3存在很强的相互作用，通过免疫共沉淀技术可在IBDV感染的细胞中检测到VP1～VP3复合物，动力学分析表明VP1和VP3在细胞质中形成复合物，随后释放到细胞培养上清液中，这一过程与成熟病毒粒子向胞外的释放几乎同时发生。另外，

有研究表明VP1与病毒毒力有关，Liu等[2]研究结果也证实了这一结论，他们利用反向遗传学技术将囊毒和细胞适应毒的B片段进行置换，来研究VP1与病毒毒力的关系，发现VP1与病毒复制效率和毒力有关。Boot等[3]通过嵌合体病毒的体内和体外实验证明，A片段编码的VP2与B片段编码的VP1内都存在有毒力因子，并且vvIBDV毒力增强部分是由B节段决定的。

同时，VP1蛋白与真核翻译起始因子4AII（eukaryotic translation initiation factor 4AII，eIF4AII）的C末端结构域相互作用。eIF4AII在加帽和不加帽mRNAs的翻译起始过程中起着重要的作用，这也说明VP1参与了mRNA的翻译过程。虽然有关IBDV的细胞嗜性以及毒力主要由VP2蛋白的高变区决定，但VP2高变区的变异还是不能解释血清Ⅰ型中的IBDV经典毒株与超强毒株在毒力上的差异。现有研究发现，病毒毒力不只是由A片段编码的VP2蛋白决定，B片段编码的VP1蛋白也可能影响病毒毒力[4,5]。

2 VP2蛋白

目前，有研究报道显示，IBDV、IPNV（Infectious pancreatic necrosis virus，鱼传染性胰腺坏死病毒）与BSNV（Blotched snakehead virus，斑点黑鱼病毒）在pVP2经VP4二次剪切形成4条短肽，这有可能是双RNA病毒特有的标志。VP2蛋白作为IBDV的主要结构蛋白，约占病毒总蛋白的51%，是病毒衣壳的唯一成份。VP2蛋白是主要的宿主保护性抗原[6,7]，与病毒中和抗体的诱导、抗原和毒力的变异和细胞凋亡密切相关。利用杆状病毒[8]、马立克病毒载体[9]、酵母菌[10]以及竹花叶病毒（Bamboo mosaic virus，BaMV）[11]表达的VP2蛋白抗原都可以有很好的保护性。

最新研究显示，利用替换HBV核心蛋白表达IBDV VP2五个模拟表位的病毒样颗粒VLP可以很好的保护鸡对IBDV的感染[12]。VP2蛋白的aa206～350区域被称为高变区，同一血清型的不同毒株的VP2的差异大多位于这一区域内，该区域也是所有中和性抗原表位存在区域，该区域具有2个亲水区（aa212D～224G和aa314T～324Q）和1个七肽区（aa326～332，SWSASGS），这些中和性抗原表位也是构象依赖性的。VP2蛋白中还具有非中和抗原表位和毒力相关表位，非中和性抗原表位主要分布于VP2 C端的保守区域，它是非构象依赖性的，可用于区分I、II 型毒株；毒力相关抗原表位位于可变区内，隶属于中和性抗原表位，具有毒力特异性，能识别强毒和弱毒，在临床上常被用来筛选理想的疫苗株。很多研究显示，VP2蛋白中的253位Gln、279位Asp、284位Ala与强毒的毒力、细胞嗜性以及致病性密切相关[13]。

同时，VP2蛋白还是一种很强的细胞程序性凋亡的引发因素，可使多种哺乳动物细胞系发生程序性凋亡，VP2蛋白的促细胞凋亡作用可以通过过表达原癌基因bcl-2来抵消。Rodrigez等[14]研究发现，不能感染B细胞（DT40）和诱导凋亡的II型毒株的VP2蛋白可以诱发鸡DT40细胞发生凋亡，并且凋亡细胞比例以及凋亡的程度与I型毒株VP2蛋白一致。近期研究显示，VP2蛋白引起细胞凋亡是由于其激活dsRNA依赖的蛋白激酶（PKR），激活的PKR引起真核起始因子2α（eIF2α）亚基的磷酸化，导致蛋白合成受阻以及细胞凋亡反应的发生[15]。

3 VP3蛋白

许多研究表明，VP3蛋白不仅是病毒的结构蛋白（约占病毒蛋白总量的40%），还与病毒粒子的各成份（VP1蛋白、pVP2/VP2蛋白、基因组RNA（ssRNA和dsRNA））以及VP3蛋白的自身多聚化有紧密的联系，是病毒结构的关键组织者。

VP3蛋白通过一段带强电荷的基序结合到VP1蛋白上，形成VP1和VP3复合物，能够改变VP1蛋白的构象，招募VP1进入病毒核衣壳中，使VP1蛋白的活性位点暴露，有利于病毒的复制。VP1～VP3复合物的形成可能是IBDV病毒粒子形态发生的关键一步；VP3蛋白与pVP2/VP2的结合是病毒衣壳化的前提。与dsRNA结合的是VP3 C末端的碱性区域，该结合过程可以起到稳定病毒的基因组，促进病毒粒子的包装，减轻dsRNA对核酸酶的敏感性，使得病毒基因组不易被降解和压缩[16]。2008年发表了精度为2.3 Å的VP3蛋白晶体结构，它由两个α-

螺旋组成一个二聚物的结构域，其中一个结构域是一个新型的结构域，与已知的蛋白结构域都不同；另外一个结构域与细菌σ因子的聚合酶互作域具有很大相似性[17]。借助定点突变技术和反向遗传技术进一步分析发现，VP3蛋白的C末端影响病毒的复制，特别是VP3蛋白的235A（多聚蛋白的990位），此处氨基酸的单一替换即可显著降低病毒的复制能力，同时也降低了该毒株在活体内抗vvIBDV感染的保护能力[18]。VP3是病毒群特异性抗原，其抗原决定簇呈线性依赖性，相对于VP2蛋白而言，VP3蛋白诱导的抗体只有很微弱的病毒中和能力，不能为机体提供免受病毒攻击的免疫保护能力。

最新的研究显示VP3蛋白具有抗凋亡的功能。VP3蛋白的表达能够阻止dsRNA依赖的蛋白激酶（PKR）以及真核起始因子2α（eIF2α）的磷酸化，从而阻断由VP2引起的细胞凋亡的发生，从而有利于病毒的复制。因此，VP3蛋白可以与痘苗病毒（VACV）E3蛋白，禽呼肠孤病毒sigmaA以及流感病毒NS1蛋白归为一类具有抗凋亡效应的病毒编码dsRNA结合多肽[15]。

4 VP4蛋白

VP4蛋白是病毒的非结构蛋白，具有蛋白酶水解活性，在病毒蛋白成熟过程中起重要作用。可促进VP1的成熟，与病毒在感染细胞后形成的Ⅱ型微管结构相关，有可能也参与了病毒粒子的组装过程，影响病毒复制的速度，但不诱导凋亡。

近年来，Zheng等[19]采用荧光双标法分析感染IBDV细胞内各病毒蛋白的亚细胞定位关系，证明F-actin与VP4存在共定位关系，且VP4主要存在于Triton X-100不溶的细胞骨架成份，这为Granzow等[20]揭示的Ⅱ型微管结构可能的成分提供研究线索。Wang等[21]致力于致病性和非致病性IBDV感染的VP4抗体监测研究，通过IFA和ELISA检测，发现致病性IBDV感染的鸡血清中VP4抗体检出率明显高于非致病性IBDV感染的鸡血清中的检出率，而且在非致病性IBDV感染的鸡血清中VP4抗体检出率很低或不能检出，提示VP4抗体可作为鉴别IBDV强弱毒株感染的一个新的生物标记。近期研究表明，VP4蛋白通过与糖皮质激素诱导的亮氨酸模式（GILZ）互作来抑制Ι型干扰素的产生[22]。

5 非结构蛋白VP5

VP5蛋白是一种由145个氨基酸组成的非结构蛋白。在I型病毒中非常保守，同源性高达95%以上，富含半胱氨酸，具有强碱性。以序列为基础的拓扑学分析显示VP5蛋白是一种II型跨膜蛋白，有一个潜在的跨膜亲水螺旋区，一个胞内N末端结构和一个膜外C末端区域。它能够聚集在宿主细胞膜上，但是在细胞膜上的聚集会导致细胞形态的改变，甚至细胞质膜的破裂。II型毒株的序列相似性却很低，I型和II毒株的VP5蛋白也存在较大的差异，是病毒复制和感染非必需蛋白。

最新研究报道称HCV的包膜糖蛋白E在VP5基因区域可以成功表达，也从一个侧面说明它对病毒在细胞内的增殖影响不大[23]。采用反向遗传学技术构建VP5蛋白缺失病毒，研究发现VP5蛋白的缺失不会影响细胞内病毒的增殖，但是会抑制子代病毒向胞外的释放，同时可以作为流式分析病毒感染的细胞表面标志[24]。有关VP5蛋白的早期研究显示，它在细胞凋亡和发病机制过程中发挥作用。VP5蛋白可以与宿主细胞电压依赖离子通道2 蛋白（voltage-dependent anion channel 2，VDAC2）相互作用来启动细胞凋亡过程[25]；但是在病毒感染的早期，有研究报道VP5蛋白具有抗细胞凋亡的功能，主要是通过与PI3K的p85α亚基的相互作用来启动PI3K/Akt信号通路，抑制早期细胞凋亡，有利于病毒感染细胞后的增殖过程[26]。

6 结语

本文系统介绍了IBDV编码的各蛋白功能的最新研究进展，有助于深入了解IBDV的致病机制，为IBD的有效防控提供理论依据。虽然国内外众多研究学者在不断探索IBDV，但是目前对IBDV的治病机理的认识依然有限，对IBD的治疗及防控依然严峻。

当IBDV侵入细胞时，会造成细胞内广泛复杂

的应答或抗病毒反应，包括干扰素、细胞因子的产生与释放，细胞膜、骨架的重排与运输，自噬的上调与下调等等，同时，IBDV也在利用病毒及细胞的各种有利条件逃逸宿主抗病毒反应以促进自我复制、组装、释放等。由于科技水平的限制加上病毒与细胞的复杂性，我们至今未能完全熟悉了解IBDV侵害细胞的具体工作机理。目前大多数研究都集中在病毒编码蛋白在分子层面是如何与宿主细胞因子相互作用的，但是对IBDV的整体系统性认识还远远不够，有待于更进一步研究。

IBDV的治病机理以下几个方面有待于进一步研究：（1）IBDV自我复制组装、释放等病毒自身特性；（2）IBDV属于免疫抑制性病毒，是如何成功避免宿主免疫系统的干扰，尤其是病毒感染早期，IBDV如何有效逃逸宿主免疫，并在感染中晚期，如何有效抑制宿主免疫系统；（3）积极探索识别IBDV的细胞膜内外受体，众所周知，细胞膜内外受体对感知病原微生物的重要性，受体感知到IBDV入侵时，能迅速传递信号到细胞内，激活胞内信号通路，但是目前对IBDV受体领域的探索还非常有限；（4）在协同进化角度探索IBDV的进化变异趋势，同时积极探索鸡群抵抗IBDV的进化协同能力；（5）IBDV与其他病毒或者致病菌（寄生虫）共感染情况下，对IBDV致病力或者IBDV对其他致病菌（寄生虫）致病力有何影响，目前文献报道较少。因此，系统性多角度研究IBDV编码的病毒蛋白功能可能会发现一些宿主细胞抵抗IBDV的机制，并为防控IBD提供有效措施。

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RESEARCH PROGRESS OF PROTEIN FUNCTIONS OF INFECTIOUS BURSAL DISEASE VIRUS

SUN Xiao-yuan, WANG San-ying, ZHOU Ji-yong, LIAO Min
(Key Laboratory of Animal Virology, Ministry of Agriculture, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

Infectious bursal disease virus (IBDV) causes an acute, highly contagious disease characterized by immunosuppression. The devastating immunosuppression leads to huge economic losses in poultry industry and also is the most important reason for the secondary infection and immune failure in no more than 3-weeks old chickens. Therefore, research of IBDV has received increasingly attention. Explanation of protein functions of IBDV helps understanding the pathogenesis, prevention and control of IBD. The recent research progress of IBDV proteins is described in this article.

Infectious bursal disease virus; protein; function

S852.659.4

A

1674-6422（2015）03-0081-06

2104-07-28

国家蛋鸡农业产业技术体系岗位专家项目（CARS-41-K11）

孙晓媛，女，硕士，助理研究员，主要从事禽传染性法氏囊病毒分子生物学研究

廖敏，E-mail：liaomin4545@zju.edu.cn