鸭Toll样受体3实时荧光定量PCR检测方法的建立

宋凯杰，陈宗艳，黄云秀,3，李传峰，孟春春，李丹丹，张淼涛，刘光清

（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241; 2.西北农林科技大学动物医学院，杨凌 712100；3.广西大学动物科学技术学院，南宁530005）

·研究论文·

鸭Toll样受体3实时荧光定量PCR检测方法的建立

宋凯杰1,2，陈宗艳1，黄云秀1,3，李传峰1，孟春春1，李丹丹1,2，张淼涛2，刘光清1

（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241; 2.西北农林科技大学动物医学院，杨凌 712100；3.广西大学动物科学技术学院，南宁530005）

根据鸭Toll样受体3（Toll-like receptor 3，TLR3）的基因序列保守区设计特异性引物，以鸭β肌动蛋白(β-actin) mRNA为内参，建立了一种检测鸭TLR3 mRNA表达水平的实时荧光定量PCR方法。该方法的标准曲线在1×102～1×108copies/μL范围内，具有良好的线性关系，相关系数和扩增效率均在0.9以上。熔解曲线显示，PCR产物为单峰，具有高度扩增特异性。重复性结果表明，该方法组内、组间变异系数均小于3 %，最低检测浓度达100 copies/μL。利用该方法检测了TLR3在鸭组织器官中的表达和分布情况，结果表明，TLR3在鸭子的各种组织或器官中均有分布，其中以气管的表达水平最高，而在脾脏的表达水平最低。该检测方法的成功建立为研究TLR3在鸭天然免疫过程中的生物学功能提供了良好的技术手段。

TLR3；荧光定量PCR；北京鸭

Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）在检测病原体相关模式分子时扮演重要角色。病原体相关模式分子是病原体保守的部分结构分子，对于病原体的生存是必要的，因此成为先天性免疫系统检测的理想目标。目前为止，从哺乳动物中已经鉴定出13种TLR3[1]，其中TLR1～9是人和鼠都具有的，TLR10只在人类中有功能，TLR11-13只存在于鼠中[2-4]。许多TLR但并不是所有的TLR被用来应答特异性的病原体相关模式分子，通过研究TLR缺陷型小鼠可确定其具体功能。相对于哺乳动物来说，禽类TLR研究进展缓慢。为全面了解TLR的结构和功能以及TLR种属差异导致的不同功能，对禽TLR进行深入研究很有必要。

目前，在鸭种属已发现TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5和TLR7。鸡TLR与哺乳动物存在一些差异[5-8]。TLR属于I型跨膜蛋白，含有N末端的配体识别区域、跨膜螺旋区和C末端的胞质信号转导区[9]。TLR3位于内体膜上，识别病毒产生的双链RNA后，激活转录因子NFkB、IRF3/7/5或者AP1，这些细胞因子合力促使细胞生成大量细胞因子和干扰素，从而抵抗病毒的感染和侵害[10]。由此看来，TLR在病毒防御起始阶段发挥了至关重要的作用。近几年，实时荧光定量PCR技术（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）广泛应用于各种动物TLR mRNA水平的检测[11,12]，国内尚未见应用此技术研究鸭TLR的报道。本研究建立了鸭TLR3的实时荧光定量PCR检测方法，同时分析了鸭TLR3在各组织的mRNA转录水平，为研究鸭TLR3在鸭发病过程中作用机制奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 菌株及主要试剂大肠杆菌Trans 5α感受态细胞、pEASY-T5-zero载体购自北京全式金生物技术有限公司；GoTaq® qPCR Master Mix、Trizol试剂、反转录酶M-MLV购自Promega公司；荧光定量PCR反应管购自爱思进生物技术（杭州）有限公司；胶回收试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。

1.2 引物设计运用Primer premier 3.0和Primer premier 5.0软件，设计了本研究中的各种引物（表1）。TLR3全长基因扩增产物引物为TLR3-F和TLR3-R，预期产物大小为2701 bp，荧光定量PCR检测引物为qTLR3-F和qTLR3-R，产物大小为239 bp；鸭β-actin为内参基因，引物为qβ-actin-F/R，预期产物大小为199 bp。

1.3 阳性标准品构建

1.3.1 总RNA的提取和cDNA合成 从北京鸭（Anas platyrhynchos）的血液中分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），Trizol法抽提总RNA，并反转录为cDNA，反转录体系为：RNA 1 μg、反转录酶M-MLV 1 μL、

5×Reaction Buffer 5 μL、核酶抑制剂RRI 1 μL、dNTP mix (10 mmol/L) 1 μL、随机引物 2 μL，补足无RNase水至25 μL体系。涡旋混合后37℃水浴条件下反应1 h，85℃、15 min灭活反转录酶，产物于-20℃储存备用。

1.3.2 阳性标准品的制备 以cDNA为模板使用

TLR3-F/R和qβ-actin-F/R分别扩增TLR3基因和β-actin内参基因。反应体系：2×Premix Ex Taq 10 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 6 μL。TLR3的PCR反应程序：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸3 min，35个循环；72℃ 再延伸10 min。β-actin的PCR反应程序：95℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃变性30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃再延伸10 min。回收PCR产物并分别克隆至pEASY-T5-Zero载体中，转化trans 5α感受态细胞，挑斑鉴定重组质粒阳性菌后，即得pEASY-T5-TLR3重组质粒，提取质粒送测序公司，对重组质粒进行测序分析。质粒于-20℃保存。

1.4 qRT-PCR检测方法的建立

1.4.1 荧光定量PCR反应体系及条件的优化 以重组质粒为模板，采用矩阵法筛选引物的最佳浓度，并对循环数进行优化。反应体系为20 μL，其中GoTaq® qPCR Master Mix 10 μL，TLR3定量PCR引 物 qTLR3-F、qTLR3-R各 1 μL，β-actin定量引物与扩增引物相同均为qβ-actin-F、qβactin-R，终浓度各为0.5 μmol/L，重组质粒模板（含1000 copies）2 μL，去离子水补足至20 μL。优化反应条件采用两步法PCR：95℃预变性2 min；95℃变性15 s，60℃退火1 min，40个循环；溶解曲线条件：95℃ 15 s，60℃ 15 s；梯度递增升温至95℃ 20 min，95℃ 15 s。同时设立无模板的空白对照（NTC）。1.4.2 TLR3 标准曲线建立 将TLR3基因PCR扩增产物克隆于pEASY-T5-Zero载体中，构建重组质粒pEASY-T5-TLR3。以重组质粒pEASYT5-TLR3为标准品，紫外分光光度计测定阳性标准品的OD260值，根据阳性标准品的分子量与质量浓度，计算其拷贝浓度。调整浓度后10倍稀释至1.0×102～1.0×108copies/μL，作为模板，进行FQ-PCR扩增，以重组质粒拷贝数的对数为X轴，循环次数（Ct）为Y轴，建立标准曲线。

1.4.3 重复性验证 对1.0×103～108copies/μL的质粒DNA进行重复验证，每个梯度3个重复，同一时期进行批内重复；不同时期对上述质粒进行批间重复。

1.4.4 敏感性验证 以拷贝浓度为1.0×101～1.0×105copies/μL的pEASY-Blunt-duTLR3重组质粒为模板进行qRT-PCR检测，同时设立空白对照（NTC）。1.4.5 特异性验证 为了分析RT-PCR扩增的特异性，用优化的条件进行PCR扩增，并分析溶解曲线；定量PCR产物经过核酸电泳后，切胶回收目的片段，测序分析其扩增基因片段特异性。

1.5 TLR3在北京鸭体内的组织表达谱采取2周龄健康北京鸭的肝脏、心脏、脾脏、肺脏、肾脏、食道、气管、腺胃、肌胃、胰腺、十二指肠、空肠、盲肠、法氏囊、胸腺、哈氏腺、脑组、皮肤、肌肉以及骨髓等脏器，称量各组织0.5 g，液氮条件下研磨，Trizol法提取组织总RNA。酶标仪测定总RNA浓度，反转录为cDNA，反转录体系：RNA (1 μg)、反转录酶M-MLV 1 μL、5×Reaction Buffer 5 μL、核酶抑制剂RRI 1 μL、dNTP mix (10 mmol/L) 1 μL、随机引物 2 μL，补足无RNase水至25 μL体系。涡旋混合后37℃水浴条件下反应1 h，85℃、15 min灭活反转录酶，产物于-20℃储存备用。以cDNA为模板，采用建立的方法进行TLR3的定量，定量PCR体系：GoTaq® qPCR Master Mix 10 μL，TLR3定量PCR引物qTLR3-F、qTLR3-R各1 μL，去离子水补足至20 μL，同时做内参β-actin对照。数据采用2-ΔΔCt方法处理，对每个组织设立3个重复，首先计算各组织的目的基因与内参基因的Ct差值，即ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（内参基因），然后计算各基因的ΔCt平均值，选取脾脏TLR3基因作为对照，用其他基因的ΔCt减去脾脏基因的ΔCt，即为ΔΔCt；2-ΔΔCt表示各组织TLR3基因的表达相对于脾脏基因的变化倍数。

2 结果

2.1 TLR3和β-actin 基因的扩增对TLR3全长和β-actin的部分基因进行扩增，结果显示获得的条带与预期结果相似（图略）。其中TLR3扩增大小为2701 bp，β-actin大小为199 bp。胶回收后连接至pEASY-T5-Zero载体、转化感受态细胞后，挑斑鉴定目的片段。测序结果使用在线BLASTn软件进行同源性比对，发现与参考序列的核苷酸完全一致。

2.2 标准曲线建立结果

2.2.1 TLR3标准曲线绘制 以1.0×102～1.0×108copies/μL重组质粒拷贝数的对数为X轴，循环次数（Ct）为Y轴，建立标准曲线，结果显示，TLR3标准品各稀释度扩增曲线良好（见图1A和图2A），Ct值相差均匀反映不同稀释度的标准品Ct值与拷贝数呈现良好的线性关系，相关系数为R2=0.999，扩增效率达90%，起始拷贝数的对数与Ct值线性关系为Y=-3.599X+37.01。

2.2.2 β-actin标准曲线绘制 以1.0×102～1.0×107copies/μL重组质粒拷贝数的对数为X轴，循环次数（Ct）为Y轴，建立标准曲线，结果显示β-actin标准曲线和扩增曲线良好（见图1B和图2B），Ct值相差均匀反映不同稀释度的标准品Ct值与拷贝数呈现良好的线性关系，相关系数为R2=0.999，扩增效率达92%，起始拷贝数的对数与Ct值线性关系为Y=-3.531X+38.05。

2.3 qRT-PCR重复性验证对1.0×103～108copies/ μL的标准品质粒DNA重复扩增，检测PCR的精确度。结果表明，Ct值变异系数均小于3%，表明该方法重复性良好（表2）。

2.4 qRT-PCR特异性验证定量PCR熔解曲线显示，溶解峰集中一致，无杂峰和小峰出现，说明扩增产物单一，无非特异性扩增；测序结果经比对分析，确定为TLR3基因和β-actin内参基因，进一步证实PCR扩增的特异性。熔解曲线显示，TLR3基因各浓度阳性标准品均在83℃出现特异性熔解峰（图3A），β-actin内参基因各浓度阳性标准品均在86℃出现特异性熔解峰（图3B）。

2.5 qRT-PCR敏感性验证取不同拷贝浓度阳性标准品进行FQ-PCR检测，结果显示：阳性标准品均出现特异性荧光扩增，阴性对照无荧光扩增，TLR3和β-actin最低检测拷贝浓度100 copies/μL，表明本试验建立的qRT-PCR方法灵敏度为1.0×102copies/ μL（见图2）。

2.6 TLR3在北京鸭体内的组织表达谱通过对样品的检测发现，TLR3基因广泛分布于北京鸭的各组织器官，在气管、食道、胰腺中表达量较高，在脾脏、骨髓、盲肠、肌胃和法氏囊表达水平较低(图4)。

3 讨论

实时荧光定量PCR技术是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新型检测技术。它是在普通PCR反应体系基础上，加入荧光染料或荧光基团，随着PCR反应的循环进行，对反应体系的荧光信号进行实时动态监测，根据相应的标准曲线确定未知样品的含量。传统的PCR定量是应用终点PCR来对样品中的模板量进行定量，通常用凝胶电泳分离，并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物。由于模板、试剂、焦磷酸盐分子的聚集等因素影响聚合酶反应，最终导致PCR反应不再以指数形式进行而进入“平台期”，而且一些反应的终产物比另一些要多，因此终点PCR反应方法定量并不准确。相比普通PCR，定量PCR省去了核酸电泳的步骤，比普通PCR的半定量分析更准确，并且不易污染从而避免出现假阳性。常用的定量PCR有探针法和荧光染料法。探针法的探针设计、合成、标记以及纯化等都相对比较困难，而且价格成本较高，往往需要设计多对引物和探针来筛选，从而无形中增加了难度。染料法特异性虽不如探针法高，但设计较为容易，成本低，而且也可以从熔解曲线来判断其特异性。定量PCR包括绝对定量和相对定量。绝对定量主要用于检测病原体的含量，在缺少内参基因的情况下，用已知模板量做外参照来定量以及用于检测单核苷酸多态性和突变分析。相对定量主要用于一些基因表达研究。

GoTaq® qPCR Master Mix 是用于实时定量 PCR (qPCR 和 RT-qPCR) 的新型试剂系统。该试剂系统包含一种新的 DNA 结合荧光染料（BRYT 绿色染料），与双链 DNA 结合后，能够产生强度高于 SYBR®Green I 的荧光，通过检测反应体系中的BRYT 绿色染料的荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。由于标准曲线方程式的斜度可以用来检查 PCR 的效率，所有线性回归分析需要存在一个高相关系数 (R2＞0.99) ，这样才能认为实验的过程和数据是可信的, 从而使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量[13]。本研究建立的标准曲线相关系数均达到0.99以上，扩增效率在90%以上，符合2-ΔΔCt方法要求，可以用于鸭TLR3的定量分析；熔解曲线分析表明，此方法扩增的TLR3和β-actin只出现一个特异性单峰，无引物二聚体或其他非特异性产物；对各稀释度标准品进行检测表明，TLR3和β-actin敏感度达100 copies/μL，可对组织中目的基因的表达进行直接检测；重复性和稳定性分析结果表明，该方法重复性和稳定性好。

对北京鸭TLR3在20种组织分布发现，在气管、

食道、胰腺呈高水平表达，这与Jiao等[14]对番鸭的TLR3组织分布的研究结果相一致，在肝脏、心脏、肾脏、腺胃、十二指肠、空肠、皮肤和肌肉呈中度水平表达，在脾脏、肺脏、肌胃、盲肠、法氏囊、胸腺、哈氏腺和骨髓呈低水平表达。研究发现，鸭TLR3广泛分布于各个组织，而在与免疫相关组织中并不是高水平表达，这可能由于机体处于健康状态，在没有病原体的感染的情况下，免疫组织的TLR3处于沉默状态，一旦机体的天然免疫系统感受到了病原体的入侵，会迅速产生应答。鸭TLR3的广泛分布从侧面也反映了机体可以全方位及时感受外源刺激，从而通过机体的各器官协作，发出危险信号，诱发机体的天然免疫系统及时作出应答反应[15,16]。Qi等[17]运用半定量的方法检测鹅TLR7的组织分布，用β-actin作为对照发现法氏囊的表达量最高。Zhao等[18]运用荧光定量PCR方法研究正常金定鸭的TLR4组织分布，发现在脾脏呈高水平表达，在胸腺、肺脏、肝脏、肾脏也有表达。Xiong等[19]运用半定量PCR分析了正常翘鼻麻鸭TLR5的组织分布，发现在肺脏、骨髓、脾脏和肝脏高水平表达，在肾脏、小肠、大肠和脑中度表达，在心脏、颈部淋巴结、盲肠和外周血单核细胞低水平表达。Megan等[20]运用半定量PCR分析了健康北京鸭TLR7的组织分布，发现在法氏囊、肺脏和脾脏高水平表达，在十二指肠、肾脏和肝脏呈低水平表达，在心和脑呈微量表达。确定TLR在不同组织的本底表达谱和表达水平不仅仅能够提示天然的病原体相关模式分子在各种组织的载量，也可以暗示组织抵抗病原体的能力[16]。

本研究成功建立了鸭TLR3实时荧光定量PCR检测方法，并绘制了TLR3组织分布谱。该技术为鸭TLR3后续的功能研究提供了便利，对于揭示鸭TLR3的抗病毒机制具有重要现实意义。

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DEVELOPMENT OF REAL-TIME FLUORESCENCE QUANTITATIVE PCR ASSAY FOR DETECTION OF DUCK TOLL-LIKE RECEPTOR 3

SONG Kai-jie1,2, CHEN Zong-yan1, HUANG Yun-xiu1,3, LI Chuan-feng1, MENG Chun-chun1, LI Dan-dan1,2, ZHANG Miao-tao2, LIU Guang-qing1
(1. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. College of Veterinary Medicine, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 3. College of Animal Sciences and Technology, Guangxi University, Nanning 530005, China)

The objective of the present study was to develop a real-time f uorescence quantitative PCR (qRT-PCR) assay for detection of duck Toll-like receptor 3(TLR3) mRNA. A pair of specif c primers were designed according to the gene sequences of duck TLR3 available in GenBank. The β-actin mRNA was used as internal control. The standard curves of this method showed good linear relationships (R2＞0.99) and eff ciency about 0.9 in the range of 1×102to 1×108copies/μL. The qRT-PCR assay was specif c for detecting TLR3 mRNA as analyzed for melting curves. In addition, the minimum detectable concentrations of positive plasmids of TLR3 and β-actin were 100 copies/μL. Both intra-assay and inter-assay coeff cients of variation were less than 3%. To verify whether this method was valid, the tissue distribution of TLR3 was examined using the qRT-PCR assay. The results showed that TLR3 was widely expressed in various tissues of duck with the highest expression level in trachea and lowest expression level in spleen.

Toll-like receptor 3; real-time RT-PCR; Peking duck

S852.42

A

1674-6422（2015）03-0042-08

2015-05-04

农业部公益性行业科研专项(201303046)；国家自然科学基金项目(31270194；31101848)；上海市科委创新项目(13391901602)

宋凯杰，男，硕士研究生，预防兽医学专业

刘光清，E-mail：liugq@shvri.ac.cn；张淼涛，E-mail：zmt6371@yahoo.com.cn