猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2的研究进展

2015-01-25 17:46王凤雪温永俊

中国预防兽医学报 2015年2期

刘莹，王凤雪，温永俊*，武华

(1.中国农业科学院特产研究所特种经济动物分子生物学国家重点实验室-省部共建，吉林长春 130112；2.华威特(北京)生物科技有限公司，北京 100085)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一种由PRRS 病毒(PRRSV)引起的猪的接触性传染病，主要引起母猪流产、死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔猪呼吸困难、败血症等。该病传播快、传染性强，被OIE 列入93 种法定报告动物疫病之一。2006 年，我国暴发了高致病性PRRS(HP-PRRS)，具有更高的发病率和死亡率，给我国的养猪业带来了严重的经济损失。目前，许多研究主要集中于揭示PRRSV 引发疾病的途径和机理以及影响毒力的相关蛋白，本文对PRRSV 的非结构蛋白2(Non-structural protein 2，Nsp2)的研究近况进行综述。

1 Nsp2概述

PRRSV 为单股正链RNA 病毒，属尼多病毒目动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)[1]。其基因组全长约15.4 nt，包含10 个ORFs，分别为ORF1a、1b、2a、2b 以及3～5、5a、6～7。其中ORF1 位于基因组5' 端，包括ORF1a、1b，总长约12 kb，约占整个基因组的3/4，编码非结构蛋白-病毒聚合酶，兼具病毒复制酶活性。位于ORF1a 终止密码子UAG 上游的7 碱基结构(UUUAAAC)和可能形成RNA 拟节的序列，是聚合酶翻译过程中核糖体移码所必须的2 种结构[2]。ORF1a 在病毒复制中，先被翻译成ppla 多聚蛋白，ORF1b 通过核糖体转移码转移成pplab 多聚蛋白。之后分别被水解为Nsp1～8和Nsp9～12，其中，Nsp2 是PRRSV 最大的复制蛋白。PRRSV 感染早期Nsp1β、Nsp2、Nsp4、Nsp7α、Nsp7β、Nsp8 定位于细胞核周，原位标记显示它们共定位的位置为病毒RNA 复制场所[3]。

Nsp2 基因长度约为2.9 kb，不同病毒株因序列存在变异而长度不一。Nsp2 的保守性最差，在美洲株和欧洲株中氨基酸序列同源性仅为32 %。其抗原表位多，而表位集中的区域容易发生基因缺失或突变。

Nsp2 包含3 个结构域，分别是靠近N 末端的半胱氨酸酶(PL2)区域、中间的高变区(HV)和靠近C 末端的跨膜区(TM)。在PRRSV 感染病毒期间，Nsp2 被PL2 水解为nsp2a、nsp2b、nsp2c、nsp2d、nsp2e 和nsp2f，这些nsp2使用相同的N 末端和不同的C 末端。Nsp2 是一个与病毒相关的PRRSV 蛋白，PRRSV 在复制过程中出现不同大小的Nsp2 亚类，他们共享PL2 区域的227 个氨基酸的N端。产生的这些不同分子量的Nsp2 可能存在不同的功能，大分子的Nsp2 出现在感染早期，可能对病毒的早期复制起关键作用[4-5]。Nsp2 以多亚型存在于病毒包膜上，在病毒包装时与病毒包膜融合有关；还存在于细胞突起上，与细胞与细胞之间的联系密切相关，其所诱导的体液免疫所产生的抗体与结构蛋白N 蛋白形成的免疫水平相当。其N 末端具有保守的催化N 末端半胱氨酸和组氨酸残基的活性，并被认为具有半胱氨酸蛋白酶的活性[6]。此外，Nsp2 还是Nsp4 丝氨酸蛋白酶的辅助因子，与细胞和组织嗜性有关[7]，在病毒复制过程中，参与多聚蛋白的装配[8]。重组真核表达质粒转染细胞发现，4 h 即可检测到Nsp2 的表达，并且主要定位于细胞核周围，随着感染时间延长，Nsp2 分布范围逐渐扩大至整个细胞质。

2 Nsp2的高变性

Nsp2 在非结构蛋白中变异性最大，包括缺失和插入，其遗传多样性在PRRSV 间比较普遍，并且其多数突变为非致死性突变。如XH-GD 株的Nsp2 编码区320 位到424位对于XH-GD 株的复制是非必需的[9]。对中国的PRRSV进行调查分析，Nsp2 基因具有广泛的变异性[10]。在我国分离的39 个病毒株中，通过Nsp2 比对可将它们分为C、G、H 和Z 4 个型，病毒同型之间仍有很大差异[11]。国内自2006 年暴发HP-PRRS，其HP-PRRSV 的变异主要以非结构蛋白Nsp2 连续缺失30 个氨基酸为特征，并且强毒株在易感细胞系中传代导致病毒毒力变弱同时伴有Nsp2 缺失的报导屡见不鲜，如TJ 株在Marc-145 中传代后的致弱的TJM 株，连续缺失120 个氨基酸；JX143 在Marc-145中传代100 代后得到的弱毒株JXM100 株，Nsp2 缺失88个氨基酸，美洲型病毒NC16845b 在细胞系中的复制速度较传统病毒株慢，它缺失了8 个氨基酸。除了传代导致基因组缺失，Gao 等首次报导了PRRSV Nsp2 天然缺失的病毒株HB-2(sh)/2002，在aa471～aa482 区间连续缺失12 个氨基酸[12]。另外还发现，在FJLYDX04 株的aa599～aa603序列中有5 个碱基的插入，这是中国第一株报导Nsp2 存在插入的病毒株[13]。此外，病毒株HZ-31 的Nsp2 区含有59 个不连续缺失，分别为aa467～aa474、aa498～aa519 和aa533～aa361，但它的481 位未像其他HP-PRRSV 株一样缺失，在遗传系统中分析，它是独立于JXA1 和EM2007的一个单独分支[14]。

Nsp2 的遗传多态性与变异性一直收到关注，并且发现能够引起基因突变的因素有很多。在宿主IFN-β 的免疫压力下，PRRSV 的分子变异几率增加，包括ORF5、Nsp2和Nsp3。PPRSV 与猪圆环病毒(PCV2a 或PCV2b)的共感染能够诱导PRRSV 的突变，如ORF5、ORF6、ORF7 和Nsp2 序列在单独感染PRRSV 时突变30 个氨基酸，PRRSV 和PCV2a 共感染时突变63 个氨基酸，PRRSV 和PCV2b 共感染时突变77 个氨基酸[15]。但这究竟与病毒毒力是否有关系，还不清楚。曾认为HP-PRRSV 毒力的增强可能与Nsp2 缺失30 个氨基酸有关，但现已被试验证明与毒力无关[16]，但Nsp2 缺失与病毒毒力的增强或减弱却始终同时发生，因此Nsp2 的变异与毒力的关系，还需要进一步研究探索。

3 Nsp2与免疫学的相关性

Nsp2 蛋白是病毒蛋白中最大的蛋白，它参与多肽的组合和病毒的复制等复杂的过程，并富含抗原表位[17]。在Marc-145 细胞中传代100 次的JX143 出现了Nsp2 不连续缺失88 个氨基酸和基因组序列随机突变的情况。JXM100具有更好的细胞适应性和病毒致弱性，在实验猪上同时注射JXM100 及其Nsp2 上缺失的88 个氨基酸能够产生更强的N 蛋白抗体，却不能产生抵抗缺失的88 个氨基酸的抗体，表明这88 个氨基酸的缺失可以作为遗传标记来区别JXM100 和JX143[18]。

近年来，关于PRRSV 对猪免疫抑制的报导主要集中在对各种细胞因子的抑制及促进方面，以间接反映宿主免疫反应情况。Beura 等发现，PRRSV 的4 个非结构蛋白对IFN-β 启动子(IRF3)活性能够起到有效的抑制作用。依据它们的影响大小，排序为Nsp1、Nsp2、Nsp11 和Nsp4[19]。Li 等证明，Nsp2 通过抵抗IFN 调节因子3(IRF-3)的活性进而强烈地抑制由仙台病毒诱导的IFN-β 产生[20]。完整的Nsp2 和Nsp2 的半胱氨酸酶活性区域(PL2)均可以抑制仙台病毒诱导的IRF-3 的磷酸化作用和核转运。在抵抗IRF-3 活性过程中，Nsp2 的PL2 是必须存在的。这表明Nsp2 在依赖IRF-3 的先天抗病毒防御中，起到重要的破坏作用。温贵兰的研究显示，Nsp2 蛋白在PRRSV 感染细胞的胞浆内分布，并与RIG-I 信号通路中的一个衔接分子MAVS 和能够激活细胞内I 型IFN 信号通路的信号分子LSml4A 共定位，但不影响IRF3 或NF-κB 入核，表明PRRSV 对先天免疫的影响可能在细胞核内[4]。Sun 等证明，Nsp2 的卵巢肿瘤蛋白酶(OTU)区域能够通过干扰NF-κB 信号转导通路，而抑制IFN-I 的产生。Nsp2 OTU区域具有泛素连接酶活性，这个区域可以通过对IκBα 聚泛素化而抑制IκBα 的降解，而IκBα 是NF-κB 的抑制因子，因此它的稳定存在，将抑制NF-κB 的活性[21]。而Fang 等证明，PRRSV WUH3 株Nsp2 蛋白的过量表达能够诱导IκB 降解，激活NF-κB。并且确定了Nsp2 的高变区(aa179～aa782)对于激活NF-κB 是不可缺少的，并且它所刺激的活性与Nsp2 全长基本一致[22]。Chen 等将6 个已经确定的Nsp2 B 细胞表位(ES2～ES7)在Ⅰ型PPRSV cDNA感染性克隆中分别删除。其中，缺失ES3(pp1a aa691～aa722)、ES4(pp1a aa736～aa790)和ES7(pp1a aa1 015～aa1040)的感染性克隆能够拯救出活病毒。在Marc-145 中，缺失ES3 的感染性克隆表现出溶细胞活性的增强和更高的病毒生长特性，缺失ES4 和ES7 变现出了溶细胞活性下降和略低的病毒生长活性。宿主体内试验表明，缺失ES3 产生了高病毒量，缺失ES4 和ES7 表现出了病毒弱化。缺失ES3 的感染性克隆刺激细胞产生了一种独特的mRNA 表达机制：能够产生IL-1β 和TNF-α 的mRNA，这表明，与野毒相比，ES3 抗原可能改变IL-1β 和TNF-α 的应答。进一步研究表明，这两种细胞因子无论在细胞中还是在PAM 中，均下调表达[23]。非结构蛋白还可以诱导产生IFN-γ 和IL-10。Burgara-Estrella 等通过动物实验确定PRRSV Nsp2 的非保守多肽(589SLYKLLLEV597)可以引起实验猪的免疫反应，并产生IFN-γ[24]。

4 Nsp2基因非必需区及重组病毒疫苗的研究

Nsp2 在病毒复制中起到十分重要的作用，但其每个区域对病毒的影响大小又是不一样的，在Nsp2 基因区存在必需区和非必需区，即Nsp2 的PL2 核心区域和直接下游区域为病毒复制的必需区，其它区域则为非必需区，可以作为外源基因的插入部位。如在HP-PRRSV 致弱病毒株HuN4-F112 的Nsp2 基因区存在两个病毒复制非必需区，插入猪瘟病毒的E2 中和表位编码区进行共表达[25]。吕健等通过互换强弱毒Nsp2 区域，构建PRRSV 嵌合感染性克隆，获得与野毒具有相似生长特性的Nsp2 替换的全长感染性克隆[26]。这些均表明Nsp2 的可改造性，将为Nsp2和PRRSV 的深入研究奠定基础。

为控制及预防PRRS 的蔓延，各国均生产出了PRRSV疫苗用于控制病情，主要为灭活疫苗和的弱毒活疫苗，我国自主研发的CH-1R 株、R98 株、JXA1-R 株、HuN4-F112 株和TJM-F92 株等PRRS 活疫苗纷纷面市。由于Nsp2 是基因组中的高变区，因此很多疫苗株的遗传标记均位于Nsp2 上。

虽然弱毒活疫苗能够为猪群提供一定保护，但由于PRRSV 表现的抗体依赖增强效应、免疫抑制及基因组的广泛变异性等生物学特征，国内外在新型疫苗如亚单位疫苗、基因疫苗和含有PRRS 免疫原型基因的重组疫苗加大了研究的力度。Kim 等通过在Nsp2 非关键区进行缺失并插入肽标记，发现拯救病毒株毒力显著降低，并能被特异抗原包被的ELISA 试剂盒检测，再次验证了Nsp2 是用来发展标记疫苗和弱毒苗的潜在靶基因[27]。单悦等对猪瘟免疫猪接种Nsp2△1882-2241 弱毒疫苗检测发现，猪外周血淋巴细胞培养上清液中IL-12 水平显著上调，IL-10 水平显著下调，而这都是基因缺失疫苗发挥效力的潜在机制[28]。梅林等通过对接种PRRSV Nsp2△1882-2241 株疫苗及感染HP-PRRSV 猪的血清中重要细胞因子表达水平进行比较，发现IL-12p40、IL-2、TNF-α 等表达水平有了明显的变化，表明机体的细胞免疫水平得到了提升[29]。Xu 等在对疫苗毒HuN4-F112 Nsp2 复制非关键区缺失25 个氨基酸，并插入新城疫N 蛋白免疫显性B 细胞表位(49 个氨基酸)作为一种基因标记疫苗，在动物体内能同时产生对抗NDV NP及PRRSV 的特异性抗体，而且缺乏针对缺失的25 个氨基酸的抗体，免疫猪获得很好的免疫保护，该疫苗可以作为一种有效的对抗PRRSV 的基因标记苗[30]。

5 小结

目前，PRRS 仍然是养猪业的主要传染病之一，了解PRRSV 的免疫机制并研制更有效并且安全的疫苗也仍然是目前的主要研究方向。Nsp2 被认为是遗传多样性最高的非结构蛋白，并且在病毒基因组中，被认为是检测PRRSV 进化和分子流行病学调查的靶基因。到目前为止，亚洲地区中流行的HP-PRRSV 仍以不连续缺失30 个氨基酸的病毒株为主。Nsp2 的高变性和已经显现出对病毒的影响，并一直受到关注。

根据现有的研究成果，可以确定Nsp2 对于动物受病毒刺激后产生免疫反应有很大的影响，在半胱氨酸酶活性区域(PL2)存在的情况下，可以抑制病毒诱导产生IFN-β；卵巢肿瘤蛋白酶(OTU)区域能干扰NF-κB 信号转导通路，抑制IFN-I 的产生；Nsp2 的高变区对于激活NF-κB 是不可缺少的，而且它所刺激产生的活性与Nsp2 全长基本一致。Nsp2 中的非必需区，可以作为外源基因的插入区域，为进一步研究Nsp2 的功能及基因组修饰改造以更深入的研究和研制疫苗具有重要意义。Nsp2 的广泛变异性，使其成为弱毒疫苗的主要遗传标记，不仅可以区分疫苗毒与野毒，还为生物安全评价提供参照。

[1]汪洪冰，范仲鑫，王卫国，等.猪繁殖与呼吸综合征的研究进展[J].湖南畜牧兽医，2013，2：1-3.

[2]Nelsen C J,Murtaugh M P,Faaberg K S.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus comparison:divergent evolution on two continents[J].J Virol,1999,73:270-280.

[3]Li Yan-hua,Tas A,Snijder E J,et al.Identification of porcine reproductive and respiratory syndrome virus ORF1a-encoded non-structural proteins in virus-infected cells[J].J Gen Virol,2012,93(4):829-839.

[4]温贵兰，张涵淞，扈鸿霞，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞中非结构蛋白Nsp2 表达分析[J].畜牧兽医学报，2013，44(7)：1109-1116.

[5]Wang Feng-xue,Wen Yong-jun,Yang Bo-chao,et al.Role of non-structural protein 2 in the regulation of the replication of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus in MARC-145 cells:effect of gene silencing and over expression[J].Vet Microbiol,2012,161(1-2):58-65.

[6]Kappes M A,Miller C L,Faaberg K S.Highly divergent strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus incorporate multiple isoforms of nonstructural protein 2 into virions[J].J Virol,2013,87(24):13456-13465.

[7]冉智光，郭鑫，王芳，等.PRRSV BJ-4 株Nsp2 部分缺失突变病毒的拯救及其细胞培养特性[A].中国畜牧兽医学会，2006 学术年会.北京：中国农业出版社，2006.

[8]Fang Y,Kin D Y,Ropp S,et al.Heterogeneity in Nsp2 of European-like porcine reproductive and respiratory syndrome viruses isolated in the United States[J].Virus Res,2004,100(2):229-235.

[9]张民泽，谢杰雄，郭泗虎，等.PRRSV XH-GD 株Nsp2 部分缺失感染性克隆的构建[J].中国预防兽医学报，2013，35(1)：10-14.

[10]Liu Jia-kui,Wei Chun-hua,Yang Xiao-yan,et al.Genetic diversity and evolutionary characterization of Chinese porcine reproductive and respiratory syndrome viruses based on NSP2 and ORF5[J].Arch Virol,2013,158(8):1811-1816.

[11]蔡雪辉.PRRSV 流行毒株NSP2 遗传变异分析及其活疫苗的安全性评价[D].长春：吉林大学，2013.

[12]Gao Zhi-qiang,Guo Xin,Yang Han-chun.Genomic characterization of two Chinese isolates of porcine respiratory and reproductive syndrome virus[J].Arch Virol,2004,149:1341-1351.

[13]刘建奎，魏春华，杨小燕，等.福建地区PRRSV 分离株Nsp2 基因新变异序列鉴定[J].中国预防兽医学报，2013，35(4)：271-275.

[14]Shen Jun-ying,Yan Xing,Dong Jian-ming,et al.Complete genome sequence of a novel deletion porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain[J].Genome Announc,2013,1(4):486-493.

[15]Yin Shuang-hui,Xiao Chao-ting,Gerber P F,et al.Concurrent porcine circovirus type 2a(PCV2a)or PCV2b infection increases the rate of amino acid mutations of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)during serial passages in pigs[J].Virus Res,2013,171(3):350-360.

[16]Zhou Lei,Zhang Jia-long,Zeng Jing-wen,et al.The 30-aminoacid deletion in the Nsp2 of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus emerging in China is not related to its virulence[J].J Virol,2009,83(10):5156-5167.

[17]马玲，李广兴，洪琴，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒HH08株Nsp2 蛋白多克隆抗体的制备及其生物学功能的研究[J].中国兽医科学，2013，43(04)：377-383.

[18]Wang Xiao-min,Sun Li-chang,Li Yan-hua,et al.Development of a differentiable virus via a spontaneous deletion in the nsp2 region associated with cell adaptation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Virus Res,2013,171(1):150-160.

[19]Beura L K,Sarkar S N,Kwon B,et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus nonstructural protein 1β modulates host innate immune response by antagonizing IRF3 activation[J].J Virol,2010,84(3):1574-1584.

[20]Li Hong-xia,Zheng Zhen-hua,Zhou Peng,et al.The cysteine protease domain of porcine reproductive and respiratory syn-drome virus non-structural protein 2 antagonizes interferon regulatory factor 3 activation[J].J Gen Virology,2010,91:2947-2958.

[21]Sun Zhi,Chen Zhen-hai,Lawson S R,et al.The cysteine protease domain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus nonstructural protein 2 possesses deubiquitinating and interferon antagonism functions[J].J Virol,2010,84:7832-7846.

[22]Fang Ying,Fang Liu-rong,Wang Yang,et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus nonstructural protein 2 contributes to NF-kappaB activation[J].Virol J,2012,9:83-90.

[23]Chen Zhen-hai,Zhou Xiao-xin,Lunney J K,et al.Immunodominant epitopes in nsp2 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus are dispensable for replication,but play an important role in modulation of the host immune response[J].J Gen Virol,2010,91(4):1047-1057.

[24]Burgara E A,Diaz I,RodriguezG I M,et al.Predicted peptides from non-structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus are able to induce IFN-gamma and IL-10[J].Viruses,2013,5(2):663-677.

[25]Xu Yan-zhao,Zhou Yan-jun,Tong Wei,et al.Study on using NSP2 protein of porcine reproductive and espiratory syndrome virus(HuN4-F112)to express E2 neutralizing epitope of classical swine fever virus[J].Bing Du Xue Bao,2013,29(1):17-25.

[26]吕健，韦祖樟，高飞，等.PRRSV 强弱病毒株嵌合感染性克隆的构建及鉴定[J].中国预防兽医学报，2013，35(4)：263-266.

[27]Kim D Y,Kaiser T J,Horlen K,et al.Insertion and deletion in a non-essential region of the nonstructural protein 2(nsp2)of porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS)virus:effects on virulence and immunogenicity[J].Virus Genes,2009,38(1):118-128.

[28]单悦，付云云，郎广平，等.猪瘟免疫猪接种PRRSV Nsp2△1882-2241 弱毒疫苗后IL-12、IL-10、TNF-α 应答特征[J].中国兽医学报，2012，32(7)：937-944.

[29]梅林，高英杰，梁智选，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒野毒株与基因缺失弱毒疫苗株TJM-F92 一步RT-PCR 鉴别方法的建立[J].中国生物制品学杂志，2012，25(4)：492-294.