乳腺肿瘤细胞对微环境成纤维细胞基因表达的影响

徐学清张　贝(南方医科大学药学院，广东广州　510515)



乳腺肿瘤细胞对微环境成纤维细胞基因表达的影响

徐学清张贝
(南方医科大学药学院，广东广州510515)

关键词:乳腺癌;成纤维细胞;肿瘤微环境;基质;基因本体;基因表达;微阵列

网络出版时间:2015－6－5 11:22网络出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.029.html

恶性肿瘤的发生不仅仅是肿瘤细胞自身的问题，而且与肿瘤微环境有密切关系。目前对乳腺癌的研究更多关注基质微环境在正常乳腺发育、原位癌发生、肿瘤生长和转移中的作用［1－2］。在本研究中，我们利用有限的细胞系观察乳腺肿瘤细胞如何改变成纤维细胞的基因表达谱和这种改变是否与他们的侵袭和转移能力相关。该研究将有助于理解乳腺肿瘤细胞侵袭和转移的机制和鉴定与他们密切相关的基因。

1　材料与方法

1.1材料Poly-A RNA Control kit购自Affymetrix公司; TRIzol RNA抽提试剂购自Invitrogen公司; RNeasy MinElute Cleanup Kit和QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit购自Qiagen公司; HS68人皮肤成纤维细胞、MCF-7、MDA-MB-231乳腺肿瘤细胞和MCF-10A上皮细胞从ATCC购买;胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培养液购自美国Gibco公司。

1.2方法

1.2.1成纤维细胞的条件培养MCF-7、MDA-MB-231和MCF-10A细胞被培养至70%～80%满后，用无血清DMEM继续培养72 h，收集培养液，12 000 r·min－1离心10 min，收集上清液作为条件培养基组分。HS68细胞被培养至70% ～80%满后用无血清DMEM继续培养4 h，然后用含10% MCF-7、MDA-MB-231和MCF-10A培养液上清的DMEM继续分别培养48 h，收集HS68细胞用于基因表达分析。

1.2.2 RNA的提取及cDNA的合成用TRIzol抽提条件培养48 h后的HS68成纤维细胞总RNA后，按照说明书用RNeasy MinElute Cleanup Kit纯化，得到的mRNA经Poly-A RNA Control Kit反转录成双链cDNA并纯化后寄送到Affymetrix公司进行microarray分析。

1.2.3 Microarray数据分析Affymetrix公司提供的原始基因数据文件检测Call值为P的数据才被用于进一步分析。当P＜0. 05、倍数变化数≥2或者＜－2的基因被认为表达有差异。聚类分析采用Spearman相关分析和平均连锁层次聚类分析法进行;本体鉴定和通路分析用GenMAPP和Gen-MAPPFinder程序鉴定。

1.2.4实时定量PCR以与芯片杂交相同的RNA为模板和GAPDH为内参，用QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit在ABI PRISMTM 7900 PCR仪上进行实时定量PCR检测CXCL1、CXCL2、IL-6、IL-8、CCL2、IL-1B的表达，每个样本重复测定3次，目的基因相对表达量的计算用ABI公司的7500 Version 2.0.1软件完成，采用ΔΔCt法计算基因表达变化倍数。

2　结果

2.1基因表达谱分析本研究从MCF-7、MDA-MB-231和MCF-10A细胞上清条件培养的成纤维细胞杂交芯片上检测到23062、23364和23736个探针。与对照组比，这3种处理的成纤维细胞内明显上调和下调的基因数分别为484、439 和1121以及629、587和1138。并且两种肿瘤细胞上清处理组的基因表达谱彼此簇集，与MCF-10A细胞处理组明显不同。

在3种处理的成纤维细胞内，与细胞周期、细胞组分、细胞增殖与生长相关的基因表达都下调了，并且下调基因本体和信号通路几乎完全相似。但3种处理导致成纤维细胞内与细胞因子、免疫反应和炎症反应相关的基因表达被上调。例如，在两种肿瘤细胞上清处理的成纤维细胞内，微阵列检测到15～50个分别与防御反应、系统免疫、细胞因子、免疫反应和趋化作用等生物学过程和分子功能相关的基因。但对外部刺激的反应有最大Z积分，分别为5. 023和5. 937。微阵列数据中的49和53个基因代表了该通路8%和9%的成员;炎症反应生物学过程中分别有19和24个成员的基因在微阵列中被鉴定，代表了该类成员的6%和10%。两种肿瘤细胞上清处理的成纤维细胞内Z积分位于前10的上调信号通路都包含Hs Cytokines and Inflammatory Response Biocarta、Hs Hypertrophy model、Hs 2-Tissues-Muscle Fat and Connective、Hs 1-Tissue-Muscle fat and connective、Complement and Coagulation Cascades。此外，两种处理的成纤维细胞有几乎完全相同的下调基因本体和信号通路。在MCF-10A处理组内，防御反应有最大Z积分(5.008)，57个被微阵列检测到的基因占该通路成员的10%。并且微阵列分别检测到46、52和13与炎症反应、免疫反应和急性炎性反应相关的基因。但是它的Z积分前12的基因本体目录中仅inflammatory response，immune response和extracellular space与MCF-7、MDA-MB-231处理组相同。信号通路中仅Hs 1-Tissue-Muscle fat and connective与后二者相同。尽管许多与趋化因子、细胞因子、生长因子、炎症因子和基质金属蛋白酶等相关的基因在3种处理的成纤维细胞内有相对一致的明显变化。但不同是，在两种肿瘤细胞上清处理的成纤维细胞内，FGF2、FGF13、PDGFA、LIF、TNFRSF9、IL1A和VCAM1明显上调;而在MCF-10A细胞上清处理的长纤维细胞内，NFATC4、C1RL、TNFSF13B、TNFSF10、TNFRSF19、BDKRB2、BDKRB1、IL-15、IL1R1、IL1R2、GRB14、FGF11、PGF、CXCL12、

CXCR7、TGFB3、IFNGR1的基因表达明显增长; IL13RA2、TNFRSF12A、TGFB2、VEGFC、FGF5、MMP1的基因表达明显下降。

2.2实时定量PCR验证所验证的6个基因的差异倍数均达到显著水平(P＜0. 05)，相对于没有处理的成纤维细胞，这些基因的mRNA在3种处理的成纤维细胞内明显增长，变化倍数4. 46～35. 01，这些结果证实了基因芯片的结果。并且就变化倍数而言，实时定量PCR的结果与基因表达位点列阵间显示了比较好的相关性。

3　讨论

肿瘤微环境内的成分与肿瘤细胞间相互影响。肿瘤细胞能调节环境中宿主细胞基因的表达以利于自身的侵袭和转移。3种细胞上清刺激的成纤维细胞的基因表达谱在本研究中都发生了明显的改变，并且这种变化谱镜像反映了3种细胞的侵袭能力。首先，癌症与炎症密切相关，宿主肿瘤反应能导致许多促炎症过程［3］。炎性因子的变化倍数以及与他们相关的通路在肿瘤细胞上清处理组比在MCF-10A细胞上清处理组内更大和有更高的Z积分。其次，LIF、TNFRS9、FGF2、FGF13、PDGFA等有利于肿瘤侵袭和转移的基因仅在肿瘤细胞上清刺激的成纤维细胞内被明显上调，而在这种变化在MCF-10A处理组内没有观察到。NFATC4和CXCL12表达的上调和MMP1、TGFB、IL-13、VEGFC、FGF5的表达下降等不利于肿瘤侵袭和转移的变化仅在在MCF-10A处理成纤维细胞内出现。因此，3种细胞上清能不同程度地调节成纤维细胞表达细胞因子、趋化因子、炎性因子等的表达，促进基质降解、血管生成、肿瘤增殖、侵袭和迁移。他们改变成纤维细胞基因表达的能力和他们的侵袭和转移能力成正相关。该研究强调了宿主基质在肿瘤迁移中的重要作用。

参考文献:

［1］Esposito A，Curigliano G.Tumor-stroma crosstalk: targeting stroma in breast cancer［J］.Curr Opin Oncol，2014，26(6): 551－5.

［2］陈淑娴，朱瑞宇，付强，等.人乳腺癌细胞及其耐药细胞转录因子表达的差异［J］.中国药理学通报，2012，28(9): 1257－61.

［2］Chen S X，Zhu R Y，Fu Q，et al.The transcription differences of mammary breast cancer cell and its adriamycin-resistant cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(9): 1257－61.

［3］Ham M，Moon A.Inflammatory and microenvironmental factors involved in breast cancer progression［J］.Arch Pharm Res，2013，36(12):1419－31.

Effect of breast tumor cells on the gene expression profiles of fibroblasts in microenvironment

XU Xue-qing，ZHANG Bei
(School of Pharmaceutical Sciences，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China)

中国图书分类号: R329.24; R73.02; R737.9

Key words:breast cancer; fibroblast; tumor microenvironment; stroma; gene ontology; gene expression; microarray

作者简介:徐学清(1978－)，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向:微生物与生化药学，通讯作者，E-mail: xu2003@ smu.edu.cn

基金项目:国家自然科学基金资助项目(No 31370782);广东省优秀青年教师培养计划资助项目

收稿日期:2015－01－17，修回日期:2015－02－05

文献标志码:A

文章编号:1001－1978(2015)07－1032－02

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.029