浙江省首次检出1株携带NDM-1基因的肺炎克雷伯菌

朱水荣，商小春，帅慧群，潘军航，梅玲玲，张 政

浙江省首次检出1株携带NDM-1基因的肺炎克雷伯菌

朱水荣1，商小春2，帅慧群2，潘军航1，梅玲玲1，张 政1

目的 对浙江省不同地区上送的临床分离株进行NDM-1基因筛检，初探浙江省NDM-1基因携带菌阳性菌存在现状。方法 应用TaqMan-MGB荧光定量PCR方法对2013年度收集的所有临床株进行NDM-1基因筛检；利用普通PCR方法对阳性株进行NDM-1基因测序、MLST分型及其它30种耐药基因检测；使用VITEK 2 Compact高级专家系统对阳性株进行微生物鉴定与耐药表型MIC测试；采用改良Hodge实验及亚胺培南-EDTA双纸片法协同试验，分别对阳性株进行碳青霉烯酶及金属β-内酰胺酶检测。结果 经对1 450株菌株进行筛检，仅从1株来自疑似病毒腹泻11月大幼儿患者粪便中分离的肺炎克雷伯菌中检出该基因，基因序列同源性为100%，该菌MLST序列型为ST1416，产碳青霉烯酶及金属β-内酰胺酶，对Levofloxacin、Trimethoprim/Sulfa敏感，对Ciprofloxacin中敏，但对其他18种所检药物均显示耐药，另携带SHV、CTX、DHA、TEM、CMY2、IMP、GES、GIM、OXA-48、SPM、AmpC、aadA1、aacA4、aphA1共14种耐药基因，结果表明该菌株的耐药表型与基因型较为符合。结论 本次从肠杆菌科肺炎克雷伯菌中检出NDM-1基因，应为浙江省首次报道，鉴于肠杆菌科细菌耐药速率传播更快，警示相关部门应重视并加强对NDM-1基因携带菌的监测与筛查。

肺炎克雷伯菌；肠杆菌科；NDM-1基因；耐药基因

2010年8月据文献报道[1]携带NDM-1基因耐药菌主要在肠杆菌科细菌间传播，引起全球关注，迄今为止，已有50多个国家相继出现产NDM-1菌株的报道，中国自2010年报道分离出3株NDM-1菌株后，我国香港、台湾、广州、上海、厦门、湖南、河北、海南等地陆续报道检出携带NDM-1基因的菌株。目前发现携带该基因的肠杆菌科细菌主要有大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、变形杆菌、枸橼酸杆菌等[1-4]。携带NDM-1基因的细菌不仅对碳青霉烯类抗生素耐药，而且由于多重耐药机制的联合作用使得其对其他种类的抗生素也具有高度耐药性。多个报道[1-4 ]表明这种多重耐药菌的广泛传播已成为严重的公共卫生问题，特别是携带NDM-1基因的肺炎克雷伯菌在欧洲还一度引起暴发流行[5]。为了解我省携带NDM-1基因耐药菌流行状况，为制订防控策略提供本底数据，本课题组按照《卫生部办公厅关于开展产NDM-1泛耐药细菌流行状况调查的通知》要求，近几年持续开展对携带NDM-1基因耐药菌进行筛检，现将2013年度检测结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 筛检菌株均来自浙江省内的杭州、台州、舟山、湖州、金华、温州等地，均由各地区或县级医院/疾病预防控制中心(CDC)检验科收集鉴定并上送，全部为临床病人分离株，主要为埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、绿脓杆菌、鲍曼不动杆菌等类菌株共1 450株。质控标准菌株：大肠埃希菌ATCC 25922 、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705及肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706。

1.2 DNA模板制备 所有待筛检菌株均划种于普通营养琼脂平板上培养，挑取2～3个单个纯菌落于装有100 μL DEPC处理水的eppendorf管中，放于金属裂解仪中100 ℃15 min后，立即置于-40 ℃冰箱中。PCR前，12 000 r/min离心4 min，取上清，4 ℃保存备用。

1.3 引物与探针 根据GenBank公布的3个NDM-1基因序列CAZ39946、HM85367864和AB571289分别设计普通PCR引物(由TaKaRa大连宝生物有限公司合成)及TaqMan-MGB荧光定量PCR引物与探针(由上海超世公司合成)。两种方法引物/探针序列见表1。

1.3.1 普通PCR 反应体系包括PremixTaq12.5 μL，引物各0.5 μL，模板4 μL，补DEPC水至25 μL；反应条件为94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min、35个循环后，延伸72 ℃ 5 min。测序：PCR扩增阳性片段产物送杭州华大基因研发中心测序，读序工具软件为Chromas，所得序列经DNAStar软件和DNAMAN软件分析、整理，并作BLASTn(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTn)比对分析相似性。

1.3.2 TaqMan-MGB荧光定量PCR 反应体系包括Premix EX Taq (2×)12.5 μL，引物各0.25 μL，MGB 0.5 μL，RoxII(50×)0.5 μL，模板2 μL，补DEPC水至25 μL；反应条件为95 ℃ 10 s 1个循环，再95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s 40个循环。

1.3.3 NDM-1基因测序与递交 PCR扩增阳性片段产物送杭州华大基因研发中心测序，读序工具软件为Chromas，所得序列经DNAStar软件和DNAMAN软件分析、整理，并作BLASTn(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTn)比对分析相似性，所得基因序列递交GenBank。

1.4 筛检阳性株鉴定与药敏 NDM-1筛检阳性菌株采用法国生物梅里埃公司VITEK 2 Compact高级专家系统(Systems版本05.01)进行菌种鉴定与药敏检测。

1.5 MLST分型 参照MLST web site 网站(http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/Kpneumoniae.html)提供的PCR扩增序列，引物由TaKaRa公司合成。对PCR扩增产物进行纯化，交由杭州华大基因科技有限公司测序，对测序结果整理修饰后，与MLST web site网站数据库进行比对，得到等位基因编号及菌株的ST序列型别。

1.6 其它耐药基因检测 针对NDM-1基因阳性菌株另进行SHV、TEM、CTX、OXA-1、CMY2、KPC、VIM、IMP、OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58、OXA-181、PER、VEB、GES、CARB、SPM、GIM、DHA、Caro、OXA-2、OXA-10、OXA-48、AmpC、aacA4、aacC1、aadA1、aphA1、gyrA共30种耐药基因多个耐药基因筛检。引物序列参考国内外文献[6-10]，个别引物序列根据耐药基因自行设计。

1.7 碳青霉烯酶表型检测 碳青霉烯酶检测采用改良Hodge试验：用灭菌生理盐水1∶10稀释E.coliATCC 25922，用灭菌棉签将此菌液均匀涂布MH平板，干后贴亚胺培南纸片，用灭菌环挑取待测菌落从药敏纸片边缘划线至平板边缘，37 ℃ 20 h，如果在待测菌与E.coliATCC 25922抑菌圈交汇处大肠埃希菌生长加强，即产碳青霉烯酶。金属β-内酰胺酶检测采用亚胺培南-EDTA双纸片法协同试验表型确认试验：0.5麦氏单位的待检菌涂布MH平板，贴两张亚胺培南纸片，相距1.0～1.5 cm，其中一张纸片上面滴加0.5 mol/L EDTA 10 μL，37℃ 过夜培养，亚胺培南加EDTA 与亚胺培南纸片抑菌圈之差大于或等于5 mm者为金属酶阳性。

2 结 果

2.1 NDM-1基因筛检结果 应用TaqMan-MGB荧光定量PCR方法，对2013年度浙江省多个地区上送的1450株临床分离株进行NDM-1基因筛检，仅1株检出NDM-1基因，该基因阳性株分离自一位疑似病毒腹泻11月大幼童患者粪便，经调查该幼儿及其父母均无出国史。

2.2 筛检阳性株鉴定与药敏 对NDM-1基因筛检阳性株进行微生物鉴定确认，菌株经VITEK 2微生物鉴定系统鉴定为肺炎克雷伯菌(99.9%符合率)，本实验室命名该菌株为KP2013ZJ01。另经VITEK 2 仪器药敏卡(含21种抗生素)检测，该阳性株仅对Levofloxacin、Trimethoprim/Sulfa敏感，对Ciprofloxacin中敏，而对其他18种所检药物均显示耐药。具体药敏检测结果见表2。

2.3 PCR扩增、测序与序列递交 应用上述普通PCR引物对NDM-1基因筛检阳性株进行PCR扩增，产物经纯化、测序，所得序列经软件比对拼接再递交NCBI进行BLAST比对，KP2013ZJ01号菌株测得序列与GenBank核酸数据库上公布的(FN396876和HQ2590570)序列同源性为100%，目前KP2013ZJ01号菌株的NDM-l基因序列已提交GenBank，序列号为KJ150296。

2.4 MLST结果 7个管家基因的PCR产物提交MLST web site肺炎克雷伯菌网站，显示该NDM-1肺炎克雷伯菌ST序列型为ST1416。

2.5 碳青霉烯酶表型检测 改良Hodge实验发现亚胺培南抑菌圈内KP2013ZJ01菌株与E.coliATCC 25922抑菌圈交汇处大肠埃希菌生长加强，呈矢状生长，应为阳性结果即产碳青霉烯酶；EDTA-增强协同试验测得亚胺培南加EDTA 与亚胺培南纸片抑菌圈之差明显大于5 mm，亦即金属β-内酰胺酶阳性，见图1、图2。

2.6 其它耐药基因检测结果 经对NDM-1基因阳性肺炎克雷伯菌进行其它30种不同耐药基因PCR检测、测序、NCBI网上blast比对发现，该菌株还携带SHV、CTX、DHA、TEM、CMY2、IMP、GES、GIM、OXA-48、SPM、AmpC、aadA1、aacA4、aphA1耐药基因，KPC及其它15种基因均未检出，部分基因PCR检测结果见图3。

1:aadA1; 2: SHV; 3: CTX; 4: DHA; 5: TEM; 6:AmpC;7: CMY2; 8: IMP; 9:aacA4;10: KPC; 11: VIM; 12: aphA1;13: GES; 14: GIM; 15: OXA-48; 16: SPM.

图3 KP2013ZJ01部分耐药基因PCR检测结果

Fig.3 Results of part resistance gene for KP2013ZJ01 detection by PCR

3 讨 论

监测NDM-1超级耐药菌的实验室诊断包括筛查、表型确认和基因确证3个步骤。本课题组运用TaqMan-MGB荧光定量PCR方法，对2013年度收集的不同类别菌株共1 450株进行了及时筛检，仅发现1株携带NDM-1基因菌株，命名为KP2013ZJ01。通过PCR及基因测序，已将该菌株NDM-1基因序列递交GenBank网站，递交序列号为KJ150296。菌株经VITEK 2微生物鉴定系统鉴定为肺炎克雷伯菌，经对该菌株进行MLST基因分型，检定其序列型为ST1416，该菌的检出应为浙江省首次报道。

NDM-1全称为“新德里金属-β-内酰胺酶”，是一种高效酶，由同名基因NDM-1编码。改良Hodge 实验检测碳氢霉烯酶和EDTA 增强、协同实验检测金属酶都有可能出现假阳性结果，但是利用这两种方法筛选碳氢霉烯酶、金属酶还是具有一定的临床意义。本次筛检出的NDM-1基因阳性株，经上述两种方法检测结果表明，该菌株产碳青霉烯酶且金属β-内酰胺酶阳性。报道表明[1-4]金属β-内酰胺酶首先在铜绿假单胞菌及不动杆菌中发现，近年来才在肠杆科细菌如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等细菌中发现。目前国外报道[1-4]携带NDM-1基因细菌主要为大肠杆菌与肺炎克雷伯菌类，国内报道则主要为院感中的主要菌株鲍曼不动杆菌等[11-14]，本课题组也于2010年检出1株携带NDM-1基因的鲍曼不动杆菌，这次检出的肺炎克雷伯菌则为肠杆菌科细菌。

由于含有NDM-1基因的质粒既能在菌株之间穿梭传递，又可在转移中发生重组，且通过携带NDM-1基因的质粒的传递，还可使对抗生素敏感的细菌获得多重耐药性，大大增加临床抗生素使用难度。鉴于携带NDM-1基因的细菌可能还存在抵抗其它抗生素的耐药基因，本次特针对该基因阳性株还开展了其它30种不同耐药基因PCR检测，结果表明该菌株有SHV、CTX、DHA、TEM、CMY2、IMP、GES、GIM、OXA-48、SPM、AmpC、aadA1、aacA4、aphA1共14种耐药基因，可见该菌株携带多种耐药基因。另将该阳性株经VITEK 2仪器药敏卡检测系统进行21种抗生素的MIC检测，发现该菌株对绝大多数所检药物显示为耐药，仅对Levofloxacin、Trimethoprim/Sulfa两种抗生素显示为敏感，可见耐药基因检测结果与抗生素表型检测结果较为符合。

研究发现携带NDM-1基因的超级耐药菌主要在住院病人中引起感染，特别是免疫力低下、正常菌群失调的病人容易引起感染，感染部位通常为血液、尿道、肺部和伤口等[15-17]。本次携带NDM-1基因阳性菌株则为一疑似病毒腹泻11月大幼儿患者粪便中分离，经调查该幼儿及其父母均无出国史。

就目前而言，携带NDM-1基因的超级耐药菌对人类致病危害还不可估计，据报道携带该基因的超级耐药菌可以耐受除多粘菌素和氟喹诺酮以外的所有抗生素[18]。考虑目前治疗该类细菌感染的临床经验十分有限，新药研发和使用需要一定时间，且浙江省人口流动量大，有利于NDM-1超级菌的输入或暴发性传播，因而快速且准确地筛检出该菌株，对于指导临床合理用药以及控制其传播与暴发流行具有重要意义。综上，鉴于肠杆菌科细菌耐药速率传播更快的特点[19-20]，警示我省相关部门应重视并加强对NDM-1基因携带菌的监测和筛查。

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Identification of aKlebsiellapneumoniastrain carryingblaNDM-1in Zhejiang Province, China

ZHU Shui-rong1,SHANG Xiao-chun2,SHUAI Hui-qun2,PAN Jun-hang1,MEI Ling-ling1,ZHANG Zheng1

(1.ZhejiangProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Hangzhou310051,China;2.XiachengDistrictCenterforDiseaseControlandPrevention,Hangzhou310003,China)

We investigated the prevalence of New Delhi metallo-β-lactamase-1 (NDM-1) producing strains by screening theblaNDM-1-positive gene using TaqMan-MGB real-time PCR in clinical isolates collected from different areas of Zhejiang Province in 2013. Sequencing of theblaNDM-1gene, multilocus sequence typing (MLST) and 30 drug resistant gene tests were performed for theblaNDM-1-positive strains. Antimicrobial susceptibility of theblaNDM-1-positive strains was analyzed by the VITEK 2 Compact System. The modified Hodge test and imipenem (IPM)-EDTA double-disk synergy test were performed to detect the carbapenemase and metallo-β-lactamase. One NDM-1-producingKlebsiellapneumoniastrain was identified in 1 450 isolates, and thisKlebsiellapneumoniastrain was isolated from stool sample of an eleven-month-old baby who was suspected of viral diarrhea. The homology with NDM-1 gene from GenBank was up to 100%. TheblaNDM-1-positiveK.pneumoniastrain was typed as ST1416, and produced the carbapenemase and metallo-β-lactamase. It was susceptible to levofloxacin and trimethoprim/sulfamethoxazole, intermediate susceptibility to ciprofloxacin, but resistant to 18 other antibiotics. Additional drug resistant genes includingblaSHV,blaCTX,blaDHA,blaSPM,blaCMY-2,blaIMP,blaGES,blaGIM,blaTEM,blaAmpC,blaOXA-48,aadA1,aacA4 andaphA1 were detected in this positive isolate, and the phenotype was coincide with its genotype. It is the first time to identify the New Delhi metallo-β-lactamase-1 (NDM-1) producingK.pneumoniafrom Enterobacteriaceae in Zhejiang Province. The faster transfer of NDM-1 gene between the Enterobacteriaceae implies that the continuous surveillance for monitoring NDM-1-producing bacteria is necessary.

Klebsiellapneumonia; enterobacteriaceae; NDM-1; drug resistant gene

Zhang Zheng, Email: zhzhang@cdc.zj.cn

卫生厅课题资助项目(2011RCB013)

张政，Email：zhzhang@cdc.zj.cn

1.浙江省疾病预防控制中心，杭州 310051； 2.杭州市下城区疾病预防控制中心，杭州 310003

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.01.007

R378

A

1002-2694(2015)01-0030-05

2014-04-25；

2014-10-29

Supported by the Department of Health of Zhejiang Province (No. 2011RCB013)