抗真菌药物与Toll样受体在固有免疫应答中的作用

吴 婷，王 敏，苏 欣，施 毅

近年来免疫抑制人群逐渐增加，真菌已成为此类人群罹患感染性疾病最主要的病原体。随着全球真菌感染发病率的增加，致死率高，对真菌感染疾病认识不足、诊断困难、抗真菌药物疗效有限且已出现耐药的现状都是临床工作中面临的困难，因此急需开拓新的治疗方向以应对真菌感染［1］。抗真菌药物除了对真菌的直接杀灭作用外，还可以通过激活机体固有免疫应答而抵御真菌感染。故本文围绕广谱抗真菌药物对固有免疫应答的影响，尤其是抗真菌药物与Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）在触发固有免疫应答间的关系作一综述。

1 真菌与抗真菌药物

1.1 真菌感染现状

自然界中约存在150万种真菌，其中仅150～400种能感染人类［2］。免疫抑制人群可发生从浅表至深部直至一系列机会性真菌感染。在地方性真菌病流行的发展中国家，免疫抑制和免疫健全人群都可罹患真菌感染［3］。在所有侵袭性真菌感染（invasive fungal infections，IFI）中，念珠菌是最主要的病原体，占70%～90%，其次是曲霉，占10%～20%，第3 位是隐球菌［4］。IFI具有高患病率和病死率，即使抗真菌治疗能带来获益，但对有危险因素的患者而言真菌感染仍是医院获得性感染的第4大病原体［5］。

1.2 抗真菌药物

两性霉素B是多烯类抗真菌药物，选择作用于真菌细胞膜上的麦角固醇，在膜上形成微孔，使细胞内K＋、核苷酸、氨基酸等物质外渗，无用物质或有毒物质渗入而致真菌死亡。两性霉素抗菌谱广，作用于念珠菌、隐球菌、毛霉、曲霉等引起的系统性感染，是重症真菌感染治疗的基石［6］。脱氧胆盐两性霉素B（deoxycholate AmB）是两性霉素B的常规剂型，脂质体两性霉素B（liposomal AmB）剂型易于吸收［5］。棘白菌素类是新型抗真菌药物，能抑制1，3-β-葡聚糖合成酶而抑制真菌细胞壁1，3-β-葡聚糖合成，从而破坏真菌细胞壁结构致真菌破裂死亡［7］。1，3-β-葡聚糖不仅是细胞壁结构，也是C型凝集素受体家族（C-type lectins receptors，CLR）中树突状细胞相关性C型植物血凝素1（Dectin-1）的配体，刺激宿主细胞TLR、CLR这类固有免疫受体，触发免疫应答［8］。棘白菌素类也能激活吞噬作用和促炎应答，其抗菌谱覆盖念珠菌、曲霉、肺孢菌等［7］。三唑类可用于系统性真菌感染，包括氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑。其能抑制羊毛甾醇14α-去甲基化酶素P450酶这一细胞色素P450蛋白超家族一员，从而抑制真菌细胞膜麦角固醇生物合成［9］。具有口服吸收特性的三唑类可用于治疗轻症或重症真菌感染，如氟康唑治疗念珠菌阴道炎，伏立康唑治疗曲霉感染。

2 抗真菌药物与固有免疫关系

众所周知，微生物与抗菌药物、微生物与免疫系统之间存在直接作用，此外，抗菌药物对免疫系统也起直接调节作用，可表现在调节吞噬作用、趋化作用、内毒素释放、细胞因子产生、免疫抑制后造血干细胞恢复、增强或抑制细胞凋亡等方面。如抗菌药物的代表喹诺酮类和大环内酯类即具有多种免疫调节作用。

固有免疫是抵抗肺部真菌感染的第一道防线，抗真菌药物能协同宿主吞噬细胞共同抵抗感染组织中的微生物［10］，在体内、体外实验中都表现出与效应细胞的协同作用［4］。在无真菌感染条件下，单纯给予两性霉素B 刺激人原代单核细胞、THP-1 细胞、HEK293细胞可 生成炎 性因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8，细胞因子单核细胞趋化蛋白（MCP-1）、巨噬细胞炎性蛋白（MIP-1β）和IL-8，前列腺素（PG）和一氧化氮（NO）［11］。确诊或拟诊真菌感染的粒细胞缺乏患者，持续3 d给予两性霉素B 后其血清中TNF-α、IL-6、IL-1-RA 增多［12］。上述结果提示两性霉素B 可激活固有免疫反应，刺激多种细胞因子、炎性因子产生。早在20 世纪90 年代，Garcha等［13］证实唑类药物与小鼠巨噬细胞、人中性粒细胞、单核细胞和单核细胞源的巨噬细胞协同杀灭真菌；Van′t Wout等［14］证实两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑能抑制巨噬细胞内念珠菌的芽管萌发；Roilides等［15］证实两性霉素B、氟胞嘧啶、酮康唑、氟康唑、Sch-39304（三唑类）、西洛芬净（LY121019）6种抗真菌药物在体外中性粒细胞应对念珠菌感染中起免疫调节作用。近期，陆续有报道新型抗真菌药物唑类和棘白菌素类的免疫调节作用［16-17］。Choi等［16］证实抗菌药物（莫西沙星）和抗真菌药物可调节免疫，抗真菌药物在体外应对烟曲霉感染的免疫应答时可发挥免疫调节作用。

三类抗真菌药物在杀灭真菌的同时与固有免疫系统协同作用，增强机体固有免疫系统对入侵病原体的抵御。TLR 类模式识别受体是这一过程中最重要的成分。TLR 在有免疫功能的组织及与外界环境相交通的呼吸道、胃肠道上都有表达，在免疫系统应对病原体入侵时识别病原体。人类已发现10种TLR（TLR1～TLR10），可识别病原体表面的病原相关模式分子（pathogen associated microbial patterns，PAMP）或者危险相关模式分子（dangerassociated molecular patterns，DAMP）［18］。TLR1识别的PAMP 是革兰阳性菌；TLR2 识别多种细菌、真菌、病毒和特定的内源性结构；TLR4 识别革兰阴性菌的脂多糖；TLR9在多种免疫细胞如树突状细胞、B淋巴细胞、单核细胞、自然杀伤细胞上表达，识别DNA 中非甲基化胞嘧啶核苷酸-鸟嘌呤核苷酸（CpG）序列［18］。

3 抗真菌药物与TLR

3.1 两性霉素B和TLR

由于两性霉素B 是革兰阳性细菌链霉菌的产物，因此推测固有免疫细胞可通过TLRs识别两性霉素B。两性霉素B 可刺激TLR1、TLR2 和TLR4。Sau等［19］研究发现TLR2和CD14受体对炎性因子TNF-α和IL-8的释放起重要作用；TLR2也对IL-1β的释放起作用。在无真菌感染情况下，TLR2-／-小鼠的 腹膜巨 噬细胞（peritoneal macrophages，PM）给予两性霉素B 刺激后不能产生TNF-α、IL-1β和IL-8，而野生型小鼠经两性霉素B刺激后上述炎性因子生成增加。给TLR4突变的C3H／HeJ（TLR4mt）小鼠PM 以两性霉素B 刺激，TNF-α生成受到抑制，但此现象仅在高剂量两性霉素B（4 mg／L）给药组时出现。TLR 应对两性霉素B刺激的反应受CD14 影响，即两性霉素B 刺激CD14-／-小鼠PM，CD4-／-细胞不 能产生TNF-α，但IL-1β生成不受此影响。上述现象均由脱氧胆盐两性霉素B触发，脂质体两性霉素B 不能刺激PM 细胞因子的生成。原因系脂质体两性霉素B 中两性霉素B 被包裹在脂质体结构中，游离的、非脂质体形式两性霉素B 浓度低，不能有效刺激TLR2／CD14和其他受体［19］。

两性霉素B对TLR1的作用由Razonable等［11］证实。抗 人TLR1 单克隆抗 体（anti-human TLR1 monoclonal antibody，anti-TLR1 MAb）处理THP-1细胞后，给予两性霉素B刺激后IL-6、IL-8、TNF-α生成都较对照组减少；予TLR2-TLR1 配体Pam-3-Cys（tripalmitoyl cysteinyl lipopeptide）刺激，IL-8 生成减少；予TLR2配体肽聚糖（peptidoglycan，PNG）刺激，则 对IL-8 产生无影响。THP-1 细胞经anti-TLR2 MAb处理后，再给予两性霉素B后，IL-8的生成抑制作用弱于经anti-TLR1 MAb 处理组；若 此时加入anti-TLR1 MAb，则IL-8的生成明显抑制。综上，结合Sau等［19］的研究表明TLR1参与到TLR2介导的两性霉素B对细胞的激活作用。

Bellocchio等［20］证实人和小鼠中性粒细胞分别经脱氧胆盐两性霉素B 或脂质体两性霉素B 处理后再予曲霉感染，致TLR2和TLR4表达上调。曲霉分生孢子和菌丝均能诱导TLR2增加，但仅菌丝诱导TLR4增加。两性霉素B 不同剂型对中性粒细胞上TLR 信号通路的激活有选择性：脱氧胆盐两性霉素B 优先激活TLR2信号通路，增加TLR2和促炎因子TNF-α；脂质体两性霉素B 优先激活TLR4信号通路，增加TLR4和抑炎因子IL-10，减少TNF-α的产生。对于TLR4-／-小鼠，脂质体两性霉素B 则起到脱氧胆盐两性霉素B 的作用，刺激TNF-α产生［20］。Matsuo等［21］用RAW264.7 cells单核细胞系证明两性霉素B 磷酸化NF-κB 的p65（RelA），通过TLR2和NF-κB调节促炎因子产生。

Salvenmoser等［22］予两性霉素B处理人中性粒细胞后再感染烟曲霉，仅TLR9表达上调。原因考虑是烟曲霉未甲基化的CpG DNA 是TLR9的天然配体，由Ramirez-Ortiz等［23］用如下实验证实：对小鼠骨髓来源树突状细胞（bone marrow-derived dendritic cells，BMDCs）和人浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cell，pDC）分别给予烟曲霉DNA 或富含CpG 的烟曲霉基因序列合成物，都能刺激TNF-α、IL-12p70、INF-γ生成；TLR9-／-的小鼠BDMCs生成TNF-α减少。综上表明TLR9识别烟曲霉DNA，促进炎性反应因子分泌，调节免疫应答。

2 棘白菌素类与TLR

Salvenmoser等［22］予卡泊芬净处理人中性粒细胞后再感染烟曲霉、念珠菌，结果示中性粒细胞应对烟曲霉感染时增加TLR2表达，而应对念珠菌感染时增加TLR4和TLR9表达。

Moretti等［24］证实卡泊芬净抗真菌效应与TLR2／Dectin-1、Dectin-1与TLR4、TLR9的关系。不同种 系Dectin-1-／-小鼠侵 袭性曲霉病（invasive aspergillosis，IA）模型给予低浓度（0.1 mg／kg）卡泊芬净后，疗效与遗传背景相关：Dectin-1-／-C57BL／6小鼠经卡泊芬净治疗后真菌生长受限、炎性反应细胞招募减少，但疗效不及野生组小鼠；而Dectin-1-／-BALB／c小鼠却无此作用。免疫完整、环磷酰胺诱导、骨髓移植3种IA 小鼠模型中，卡泊芬净的抗真菌疗效表现出“矛盾现象”（the Eagle effect）：低浓度（0.1 mg／kg）时抑制真菌生长，减少炎性反应细胞招募；而高浓度时（5 mg／kg）则不能抑制真菌生长，增加炎性反应细胞招募。但在Dectin-1-／-的2种种系小鼠中及TLR2-／-的C57BL／6小鼠IA 模型中卡泊芬净的“矛盾现象”消失，即低浓度时不能抑制真菌生长，高浓度反而抑制真菌生长。综上表明卡泊芬净抗真菌作用依赖TLR2／Dectin-1。在TLR4-／-、TLR9-／-C57BL／6小鼠IA 模型中，TLR4-／-小鼠卡泊芬净的“矛盾现象”也消失，表明TLR4部分参与卡泊芬净TLR2／Dectin-1依赖的保护作用；对于TLR9-／-小鼠，低浓度和高浓度卡泊芬净治疗，均抑制真菌生长、减少炎性反应细胞招募，表明TLR9抑制卡泊芬净的抗曲霉作用［24］。

Moretti等［25］证实米 卡芬净 治疗小 鼠IA 时TNF-α减少，IL-10增加，具有免疫调节作用。IL-10-／-小鼠IA模型分别给予1 mg／kg和10 mg／kg米卡芬净，2种浓度下肺组织菌落负荷均降低，但播散到脑组织的菌落负荷增加，病理炎性反应加重，中性粒细胞招募增加、促炎因子TNF-α和IL-17增多，说明米卡芬净的 抗炎作用需IL-10 参 与。在Dectin-1-／-、TLR2-／-、TLR3-／-、TLR4-／-、TLR9-／-、MyD88-／-（Dectin-1、TLR2、TLR4、TLR9的下游蛋白）及TRIF-／-（TLR3、TLR4的下游蛋白）的小鼠IA 模型分别给予1 mg／kg和10 mg／kg米卡芬净治疗，疗效有差异：TLR2-／-小鼠在2种剂量下疗效与野生组相比差异无统计学意义；在野生组中，1 mg／kg 米卡芬净的疗效与未治疗组无差别，10 mg／kg米卡芬净能降低菌落负荷，减轻组织炎性反应，但 在Dectin-1-／-、TLR2-／-、TLR3-／-、TRIF-／-小鼠中该作用消失；2种剂量都使Dectin-1-／-、TRIF-／-小鼠肺部菌落增加，组织炎性反应加重；仅10 mg／kg剂量使TLR3-／-小鼠疗效恶化。上述结果表明低浓度（1 mg／kg）米卡芬净激活Dectin-1／TRIF信号通路，而高浓度（10 mg／kg）米卡芬净需要Dectin-1、TLR2、TLR3和TRIF共同参与才能起到保护性作用。给予TLR4-／-、TLR9-／-和MyD88-／-小鼠10 mg／kg治疗，其疗效与野生型相似，表明高浓度卡泊芬净不依赖上述信号通路。高浓度米卡芬净的抗真菌作用也体现在炎性反应因子的表达上，10 mg／kg治疗下Dectin-1-／-、TLR2-／-、TLR3-／-、TRIF-／-小鼠IL-10减少，除TLR3-／-小鼠外，其余小鼠促炎因子TNF-α增加。而TLR4-／-、TLR9-／-和MyD88-／-小鼠中IL-10 和TNF-α与野生组无差异。综上，作者认为，TLR2／Dectin-1 和TLR3／TRIF信号通路参与米卡芬净的抗炎反应［25］。

3 唑类药物与TLR

有限的研究数据表明唑类药物也触发TLR 介导的免疫应答。Salvenmoser等［22］予伏立康唑预处理人中性粒细胞后感染烟曲霉致TLR2、TLR4、TLR9 表达上 调。Simitsopoulou 等［17］研究表 明THP-1单核细胞予烟曲霉及伏立康唑处理，均可诱发不同程度的抗真菌应答：单独给予烟曲霉菌丝或伏立康唑都可致THP-1细胞TLR2和TNF-α表达增加，且伏立康唑单独作用效果强于烟曲霉菌丝单独作用；二者共同刺激THP-1时TLR2和TNF-α增加最明显。然而，无论是烟曲霉菌丝或伏立康唑单独或联合应用都不能增加TLR4表达。此外，伏立康唑单独刺激THP-1细胞致NF-κB核移位增多，强于烟曲霉菌丝的单独作用；但同时给予伏立康唑和烟曲霉菌丝致NF-κB核移位量最多［17］。综上，该研究证实伏立康唑激活TLR2信号通路、TNF-α和NF-κB，在应对烟曲霉感染时通过免疫调节进而增强应答效力。

4 结语

两性霉素B、棘白菌素类、唑类药物三类抗真菌药物的作用机制早已证实，但其通过触发TLR 及其信号通路，以协同作用的方式增强固有免疫应答、共同清除真菌感染的作用机制为抗真菌药物的免疫治疗提供新的思路，但目前尚缺乏临床转化研究。本文综述了抗真菌药物在体内、体外实验中对固有免疫调节作用的研究进展，对于今后探索抗真菌药物的免疫治疗提供一定依据。

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