小睑裂综合征家系FOXL2基因突变检测分析

陈琳琳 郑颖洁 乔 洁 宋怀东 范先群▲.沈阳市第四人民医院，辽宁沈阳 00；.上海爱尔眼科医院，上海 00050；.上海交通大学医学院附属第九人民医院，上海 000；.上海交通大学医学院附属瑞金医院内分泌研究所，上海 0005

小睑裂综合征家系FOXL2基因突变检测分析

陈琳琳1郑颖洁2乔 洁3宋怀东4范先群3▲
1.沈阳市第四人民医院，辽宁沈阳 110031；2.上海爱尔眼科医院，上海 200050；3.上海交通大学医学院附属第九人民医院，上海 200011；4.上海交通大学医学院附属瑞金医院内分泌研究所，上海 200025

目的探讨小睑裂综合征（BPES）遗传学发病机制，确定BPES家系临床表型，检测FOXL2基因突变位点。方法收集并追溯调查BPES大家系全体家系成员，对其进行全面体格检查及眼部专科检查；对已收集到的BPES家系中全部患者按照眼科分型标准进行确诊、分型，即遗传学的表型确定；所有现存家系成员性激素水平及卵巢功能检测（女性），女性患者行腹部B超检查，BEPS伴卵巢早衰（POF）患者行人体绒膜促性腺激素（HCG）兴奋试验。全体家系成员取外周血5 mL，常规提取DNA，纯化后的PCR产物送测序。 结果该家系共24人，现存17人，其中BPES患者7例，现存6例BPES患者中，女性患者均存在生殖异常，为BEPSⅠ型，进一步完善该家系全部成员的体格检查及女性患者卵巢功能检查、人绒毛膜促性腺激素兴奋试验、血清学检查结果，支持POF的临床诊断。基因测序检测到FOXL2基因：C.429C＞A（提前的中止密码）。 结论系谱分析表明该家系遗传方式为常染色体显性遗传，常染色体显性BPES存在遗传异质性，同一家系中不同个体间也有不同；基因测序检测到的FOXL2基因：C.429C＞A（提前的中止密码）突变为新的突变位点。

小睑裂综合征；FOXL2基因；基因突变

小睑裂综合征（blephar-ophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome，BPES）是较为常见的眼病之一，是一种常染色体显性遗传病，其表现为双眼上睑下垂、睑裂狭小、倒向性内眦赘皮、内眦间距增宽，常可伴有下眶缘发育不全和下睑外翻。Vignes将其临床上分为两个表型：Ⅰ型外显率为100%，由男性患者遗传给下一代，下一代男女均可发病，临床除BPES、颅面部发育不全表现外，女性患者还表现为不孕，原发性闭经或提前闭经、小子宫和卵巢功能早衰（premature ovarian failure，POF），而男性患者生育功能正常；Ⅱ型外显率约为96.5%，只表现BPES体征而无性别差异且男女无生育功能障碍[1]。曾有多项研究报道1例BPES女性患者发展成为子宫内膜癌[2-3]。本研究对自2007年开始收集的家系中一BPES（Ⅰ）型大家系进行临床遗传学分析，并对其突变基因进行检测。

1 对象与方法

1.1 对象

收集2007年9月上海交通大学医学院附属第九人民医院眼科确诊的1个BPES大家系，追溯调查该家系成员共计24名，现存17名，患者7例，现存6例。以上所有家系成员均否认近亲婚配，患者母亲否认孕期用药及患病史，所有患者均否认早产史。参与研究者均经知情同意并自愿参与本次研究。本次研究起止时间为2007年9月～2012年12月。

1.2 主要设备及试剂

直接检验镜（德国舌牌）、手持裂隙灯（德国舌牌）、乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝的VACUETTER型真空抗凝采血管（Greiner bio-one公司）、ACD抗凝剂、1 mol/L的Tris-HCL缓冲液 （pH 8.0）、5 mol/L的EDTA溶液（pH 8.0）、TE缓冲液（pH 8.0）红细胞裂解液、白细胞裂解液、蛋白酶K液（20 mg/mL）、苯酚-氯仿-异戊醇（25∶24∶1）、10%十二烷基磺酸钠（SDS）、480型热循环仪 （Perkin-Elmer公司）、PCR产物回收柱（Qiagen，Promega公司）、水平式琼脂糖电泳设备（上海精益有机玻璃加工厂）、TE缓冲液 （pH 7.6、8.0）、ABI 3730 DNA测序仪 （Applied Biosystems Perkin Elmer，Foster，CA）、割胶纯化试剂盒（QIAGEN，Mississauga，Ontario，Canada）、分子量标志物PCR Marker、Taq酶及其相关试剂（Promega公司）、琼脂糖粉（中科院上海药物研究所）、TBE缓冲液。

1.3 研究方法

1.3.1 临床资料收集

①严格按照国家和国际有关伦理学要求进行家系收集，并对已收集到的BPES家系中所有患者按照眼科分型标准并参照McKusick《在线人类孟德尔遗传》（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）进行确诊、分型，即遗传学的表型确定。②分析家系成员婚孕情况。③对所有家系成员进行全面体格检查，除外眼外疾患，眼部除上述表现外未见明显异常。④女性患者均行腹部B超检查。

1.3.2 性激素水平及卵巢功能检测

黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、雌二醇（E2）、孕酮（P）、睾酮（T）、去氢表雄酮（DHEA-S）、17羟孕酮（17-OHP）和皮质醇、醛固酮水平。

1.3.3 采用PCR检测患者基因序列

采集现存6例家系成员外周血5 mL，加枸橼酸钠抗凝后，-20℃冻存备用。常规DNA提取，-70℃保存备用。

1.3.3.1 基因组DNA的提取 抗凝血10 mL加入50 mL的塑料离心管中，加30 mL预冷的红细胞裂解液，冰浴10 min，4℃4000 r/min离心10 min，弃上清；加30 mL预冷的红细胞裂解液，冰浴10 min，4℃下4000 r/min离心10 min；加入100 μL预热的20%SDS，40 μL的蛋白酶K，45℃过夜消化，80～100次/min轻轻振荡；离心10 min后，取上清；用等体积酚-氯仿-异戊醇抽提1次；在上清中加入0.1 mL的醋酸钠，2倍体积的无水乙醇（-20℃预冷），上下颠倒，直至析出絮状沉淀；用玻璃棒挑出沉淀，装入事先加有100%乙醇的1.5 mL的Eppendorf管中，13 000 r/min离心20 min，洗涤，弃乙醇，沉淀，自然干燥30 min，用TE溶解500 μL。待DNA在室温下完全溶解后，吸出1 μL，溶解于99 μL ddH2O中，用0.1 mL的双蒸水作为空白管，用紫外分光光度仪分别检测260 nm和280 nm的吸光度（OD值）。最后，进行DNA纯度和质量的鉴定，DNA浓度=波长260 nm处读数×稀释倍数。

1.3.3.2 PCR反应 Primer AB：PrimerA及PrimerB各0.5 μL（表1）、DNA模板1.0 μL、10×Buffer 2.0 μL、dNTPs 0.5 μL、Taq酶 0.5 μL、ddH2O加至 20 μL；Primer ab、cd：Qsolution 4.0 μL、Primer a/c 0.5 μL、Primer b/d 0.5 μL、DNA模板 1.0 μL、10×Buffer 2.0 μL、dNTPs 0.5 μL、Taq酶0.5 μL、ddH2O加至20 μL。PCR循环在Perking-Elson 480型DNA热循环仪上完成PCR循环。PCR反应条件：Primer AB：95℃预变性5 min；95℃变性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。Primer ab、cd：未加Taq酶：95℃预变性5 min，80℃变性10 min。加Taq酶：95℃预变性5 min，95℃变性30 s、56℃退火40 s、72℃延伸50 s，35个循环；72℃延伸10 min。反应结束后，使用1.5%琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，在紫外灯下观察经溴乙锭染色的凝胶，可见所需长度的单一特异片段。在Model PROTENⅡXi Cell型电泳仪（Bio-Rad公司）上电泳，使用冷循环将电泳温度控制在20℃以下，所用电压为120～150 V，依据DNA片断的长度调整电泳时间，15～20 min。

1.3.3.3 PCR产物割胶纯化 PCR反应结束后，经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色后可见单一特异条带，符合此外显子长度片断；从凝胶中回收提纯PCR产物：使用清洁无菌的手术刀片切下所需条带，称重；加入3倍体积的QG缓冲液，50℃温育10 min，每2～3分钟摇荡，使胶充分溶解；再加入1倍体积的异丙醇混匀；将其注入下套2 mL收集管的纯化试剂盒柱中，13 000 r/min离心1 min；弃流出液，加入0.5 mL的QG，离心1 min；弃流出液，加入0.75 mL的PE缓冲液再离心1 min；弃流出液，13 000 r/min离心1 min；柱下方套清洁的1.5 mL的离心管，13 000 r/min离心1 min；待DNA溶解后，再取2 μL电泳，确定浓度。

1.3.3.4 测序 纯化后的PCR产物测序由国家人类基因组南方研究中心完成。

1.3.4 人体绒膜促性腺激素（HCG）兴奋试验

对BPES伴POF患者行HCG兴奋试验，早晨8：00采集患者空腹（基础）促凝血5 mL，于采血后立即注射HCG注射液1500 U，分别于注射后24、48、72 h采集空腹促凝血5 mL，分别检测各时段FSH、LH、PRL、E2、P、T、DHEA、17-OHP。

2 结果

2.1 BPES大家系全体家系成员临床资料及遗传情况分析

共有家系成员24名，现存17名，BPES患者7例。现存的6例BPES患者中，男1例，女5例，男性患者生育正常，女性患者均未生育，并均于20岁左右开始出现月经异常，其中2例患者已行子宫切除术。家系系谱表明BPES在传代中连续相传，且男女发病风险相同，故这些家系均为常染色体显性遗传，见图1。

2.2 先证者一般资料及临床检查情况

女，20岁，曾于当地医院行腹部B超检查示（图2）：子宫前倾，前后径2.7 cm，子宫内膜厚0.3 cm，肌层回声均匀。左卵巢2.5 cm×1.5 cm；右卵巢2.50 cm× 1.35 cm，双卵巢未见确切发育卵泡，可见小卵泡约0.25 cm×0.30 cm。提示：①子宫未见确切异常；②双卵巢未见发育卵泡。当地医院性激素检测报告示：E2：163.0 pg/mL，P：0.49 ng/mL。

2.3 体格检查及卵巢功能检查、HCG兴奋试验结果比较

该家系为BEPSⅠ型，进一步完善该家系全部成员的体格检查（图3），对第三代的2例患者（Ⅲ5、Ⅲ13）及第四代的1例女性患者（Ⅳ2）血清学检查及女性患者进行卵巢功能检查结果，结果发现3例女性患者基础E2降低而FSH（卵泡期血中FSH正常值为5.2～14.4 mU/L、LH（正常值：1.8～7.4 mU/L）升高，尤其FSH≥40 mU/L时，提示POF，见表2。HCG兴奋试验发现，Ⅲ5、Ⅲ13、Ⅳ2患者HCG注射24、48 h后，激素水平无明显升高，提示POF，见表3。

2.4 突变检测结果

基因测序检测到FOXL2基因：C.429C＞A（提前的中止密码），见图4。

3 讨论

BPES作为一种少见的遗传性疾病最早在1889年由Vignes报道，Matsuoka等[3]曾经报道1例女性BPES患者罹患子宫内膜癌，与POF相关的闭经是患子宫内膜癌的风险因素。BPESⅠ型的女性患者如发生月经改变应该进行定期的妇科检查。基础E2水平降低而FSH，LH升高，尤其FSH≥40 mU/L时，提示POF。FOXL2基因是单外显子基因，长约2.7 kb，编码376个氨基酸，含有两个功能域，分别为101个氨基酸的DNA结合域和有14个保守残基的多聚丙氨酸序列。FOXL2是一个假定编码了一个叉头结构域的转录因子，位于3q23（MIM#605597），其突变可导致两种类型的BPES（BPES；MIM#110100），是一种常染色体显性遗传性疾病[5]。细胞遗传学研究已证明BPES是由3q23的FOXL2基因突变所引起。除了FOXL2基因以外，还有一些叉头基因如FOXE1、FOXC1、FOXC2及FOXP3，他们都与遗传性疾病有关，其中两个可发生眼部异常[4]。

起初有学者提出FOXL2的单倍剂量不足与BPES的形成有关，并揭示了起初的基因型与表型的关系[5-7]。有学者发现两种类型之间存在表型的交错，并提出在一部分BPES患者中，基因缺陷并没有位于FOXL2的编码区内，但却产生了位置效应[7]。后来的研究揭示了两种突变热点的存在，证明了家系内和家系间的表型变异性，同时提示人们要用一种分子学的检测手段来在少数的突变患者中预测POF的发生风险[8]。

迄今为止，在全球内报道过的206个不同种族的BPES家系中共发现有106个特征性的FOXL2基因内突变[9-18]。所有的突变都发生在基因的编码区内，其中错义突变占11%，无义突变占12%，移码突变占44%，读码框内改变占33%[7-8]。

本研究在此家系中发现的突变为新的基因突变，其功能有待进一步研究。

[1]Zlotogora J，Sagi M，Cohen T.The blepharophimosis，ptosis and epicanthus inversus syndrome：delineation oftwo types[J].Am J Hum Genet，1983，35（5）：1020-1027.

[2]Stromme P，Sandboe F.Blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome（BPES）[J].Acta Ophthalmol Scand，1996，74（1）：45-47.

[3]Matsuoka Y，Shibuya Y.Endometrial carcinoma in a patient with blepharophimosis syndrome and menstrual abnormality[J].Am J Ophthalmol，1997，124：855-856.

[4]Prueitt RL，Zinn AR.A fork in the road to fertility[J].Nat Genet，2001，27（2）：132-134.

[5]Crisponi L，Deiana M，Loi A，et al.The putative forkhead transcription factor FOXL2 is mutated in blepharophimosis/ptosis/epicanthus inversus syndrome [J].Nat Genet，2001，27（2）：159-166.

[6]Heinisch U，Zlotogora J，Kafert S，et al.Multiple mutations are responsible for the high frequency of metachromatic leukodystrophy in a small geographic area [J].Am J Hum Genet，1995，56（1）：51-57.

[7]De Baere E，Dixon MJ，Small K，et al.Spectrum of FOXL2 gene mutations in blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus（BPES）families demonstrates a genotype-phenotype correlation[J].Hum Mol Genet，2001，10（15）：1591-1600.

[8]De Baere E，Beysen D，Oley C，et al.FOXL2 and BPES：mutational hotspots，phenotypic variability，and revision of the genotype-phenotype correlation[J].Am J Hum Genet，2003，72（2）：478-487.

[9]Diane B，Jo V，Ludwine M，et al.The human FOXL2 mutation database[J].Human Mutation，2004，24（3）：189-193.

[10]Jiang HO，Huang XS，Su ZG，et al.Genetic analysis of the forkhead transcriptional factor 2 gene in three Chinese families with blepharophimosis syndrome [J].Molecular Vision，2013，19：418-423.

[11]Fan JY，Wang YF，Han B，et al.FOXL2 mutations in Chinese families with blepharophimosis syndrome（BPES）[J]. Transl Res，2011，157（1）：48-52.

[12]Cha SC，Jang YS，Lee JH，et al.Mutational analysis of forkhead transcriptional factor 2（FOXL2）in Korean patients with blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome[J].Clin Genet，2003，64（6）：485-490.

[13]Crisponi L，Uda M，Chiappe F，et al.Genetic basis for nonsyndromic and syndromic，blepharophimosis/ptosis and epicanthus inversus syndrome（BPES）-associated premature ovarian failure（POF）[J].Am J Hum Genet，2002，71（Suppl）：324.

[14]Fokstuen S，Antonarakis SE，Blouin JL.FOXL2-mutations in blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome（BPES）：challenges for genetic counseling in female patients[J].Am J Med Genet，2003，117A（2）：143-146.

[15]Kosaki K，Ogata T，Kosaki R，et al.A novel mutation in the FOXL2 gene in a patient with blepharophimosis syndrome：differential role of the polyalanine tract in the developmentoftheovaryandtheeyelid[J].OphthalmicGenet，2002，23（1）：43-47.

[16]Kumar A，Babu M，Raghunath A，et al.Genetic analysis of a five generation Indian family with BPES：a novel missense mutation（p.Y215C）[J].Mol Vis，2004，10：445-449.

[17] Or SF，TongMF，Lo FM，et al.Three novel FOXL2 gene mutations in Chinese patients with blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome[J].Chin Med J（Engl），2006，119（1）：49-52.

[18]TangS，WangX，LinL，etal.MutationanalysisoftheFOXL2 gene in Chinese patients with blepharophimosis-ptosisepicanthus inversus syndrome[J].Mutagenesis，2006，21（1）：35-39.

Mutation analysis of FOXL2 gene in a Chinese family with Blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome

CHEN Linlin1ZHENG Yingjie2QIAO Jie3SONG Huaidong4FAN Xianqun3▲
1.The Forth Hospital of Shenyang,Liaoning Province,Shenyang 110031,China;2.Aier Eye Hospital of Shanghai, Shanghai 200050,China;3.Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011,China;4.Institute of Endocrinology,Ruijin Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200025,China

ObjectiveTo investigate the pathogenesis of blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome(BPES), and confirm the clinical phenotype of this family with BPESⅠand find the mutation of FOXL2 gene.Methods BPES family were collected and researched directly,and the pedigree was sketched.Strict ophthalmic examination was given to all the family members.All the examination results were collected and analyzed digitally.They were detected with sex hormone level and ovary function(female).The female patients were detected with B ultrasonic examination on abdomen.The female BPES patients with POF were detected by HCG stimulation test.5 mL peripheral blood was collected from the proband and the members of the family.Genomic DNA of the peripheral blood from each of the family members was extracted with routine phenol-chloroform method.After purification of PCR production,all the DNA sequences were automatically determined with double deoxidation termination method commercially.The mutation detection was applied to the family members.Results Retrospective survey was made for 24 members from this BPES family, among whom 7 cases were BPES patients and direct survey was made for 17 living members,among whom 6 cases were alive,all female suffered from reproductive abnormalities,were the BEPS type I.Further improved the physical examination of all the family members,ovarian function,HCG excited tests of women,serological test results,all these results supported the clinical diagnosis of POF.FOXL2: C.429C＞A (an untimely terminal code)was detected by gene sequencing.Conclusion The inheritance mode of BPES is autosomal dominant inheritance;the clinical presentation (phenotype)of BPES varied in different individual cases;new gene mutations are found in this family:C.429C＞A,an untimely terminal code.

BPES;FOXL2 gene;Gene mutation

R777.1

A

1673-7210（2015）03（c）-0017-05

2014-12-20本文编辑：任 念）

中国博士后基金项目；辽宁省百千万人才专项基金资助项目。

陈琳琳（1972.5-），女，博士，上海交通大学医学院附属第九人民医院眼整形博士后，美国迈阿密大学Bascom Palmer眼科研究所访问学者，中国中西医结合眼科分会泪器病学组委员，主要从事眼整形、眼眶病、泪道系统疾病的临床和基础研究。

▲通讯作者