细胞型FLICE样抑制蛋白、T-box转录因子在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及意义

张颖奇 李 华 徐 波 满 一 刘微丽

1.中国石油天然气集团公司中心医院口腔科，河北廊坊 065000；2.中国石油天然气集团公司中心医院介入导管室，河北廊坊 065000；3.郑州人民医院口腔科，河南郑州 450000

口腔鳞状细胞癌 （oral squamous cell carcinoma，OSCC）是一种常见于口腔颌面部的恶性肿瘤，在口腔颌面部恶性肿瘤中占有相当高的比例，每年有几十万人患病，威胁着人们的生活质量及生命，是一种严重危害人类健康的重大疾病[1-2]。而肿瘤的发生是内外界因素长期作用于人体细胞的结果，因此，学者认为口腔颌面部肿瘤是危害人们健康及生活质量的一种慢性病。而在肿瘤的发生、发展及转移的过程中可能有多个因素及多种机制的参与，如不良生活习惯、理化因素、机械刺激因素、生物学因素以及基因突变[3-4]。研究表明，细胞型FLICE样抑制蛋白（cFLIP）及T-box转录因子（TBX2）在多种肿瘤组织中表现为高表达，故深入探讨两者在肿瘤中的作用，有助于OSCC的防治。

1 材料与方法

1.1 病例选择及分组标准

标本来源:由吉林大学口腔医学院及郑州大学第一附属医院病理科提供。选择病例标准:所有病例术前未行放疗、化疗等任何治疗。术后均经病理组织学确诊。其中男37例，女20例；年龄40～73岁，中位年龄66岁；伴淋巴结转移者48例，无淋巴结转移者9例；临床分期分为Ⅰ期5例、Ⅱ期7例、Ⅲ期26例、Ⅳ期19例[国际抗癌联盟（UICC）2002年分期标准]。另外部分取口腔黏膜上皮异常增生（DOM）组织（位于癌变组织与正常黏膜交界部位，组织学表现为不典型增生）38例，男21例，女17例；取距离癌肿边缘 5 cm处的正常口腔黏膜（NOM）30例，男15例，女15例。本研究经医院伦理委员会通过，患者知情同意并签署知情同意书。

1.2 主要试剂

鼠抗人单克隆抗体c-FLIP和TBX2。生物素化兔抗山羊二抗IgG、SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、Trizol试剂；M.MLV 逆转录酶，Oligo（dT）12-18 引物，TagDNA聚合酶，硝酸纤维素膜，羊抗兔β-actin抗体，预染蛋白marker，BCATM蛋白定量试剂盒。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组织化学方法

1.3.1.1 处理组织切片，固定，标本染色:加入1∶150的一抗cFLIP/TBX2的单抗，4℃过夜。加入生物素化二抗工作液，置室温下20 min，PBS漂洗后加入试剂SP，室温下20 min，PBS洗后经DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，封片。

1.3.1.2 结果判断。采用显微镜进行观察，随机选5个高倍镜视野（每个视野可见细胞数目≥200个）。镜下免疫组化阳性表达于细胞质，呈颗粒样、棕黄色。结果判定:①0分=细胞无染色；1分=细胞呈浅黄色；2分=细胞呈棕黄色；3分=细胞呈棕褐色。②1分=阳性细胞数所占百分比＜30%；2分=阳性细胞数所占百分比为30%～70%；3分=阳性细胞数所占百分比＞70%。总积分=①、②两项评分的乘积；阴性结果（-）:0～1 分，阳性结果（＋）:≥2 分。

1.3.2 RT-PCR法

1.3.2.1 引物的设计与合成。

1.3.2.2 提取组织总RNA。采用Trizo试剂进行提取，其优点是RNA不易降解，且提取的RNA纯度较好。步骤如下:裂解组织，RNA抽提，RNA沉淀，RNA洗涤，RNA溶解。测定总RNA浓度和纯度的:空白对照是DEPC-H2O。

1.3.2.3 逆转录（RT）以mRNA为模板，合成单链cDNA。

1.3.2.4 聚合酶链反应（PCR）在相应的反应条件经过变形-退火-延伸下进行PCR，然后定量分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件录入、处理实验数据。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验。相关性采用Spearman相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 cFLIP和TBX2在三种组织中的表达情况

显微镜下:cFLIP和TBX2的阳性表达呈棕黄色，定位于细胞质；cFLIP的阳性表达率:OSCC为91.23%，DOM为84.21%，NOM为10.00%。cFLIP在OSCC、DOM两种组织中的表达较高，而cFLIP在NOM表达相对较低；OSCC、DOM与NOM的cFLIP表达差异有统计学意义 （P＜0.05），OSCC与 DOM的cFLIP表达差异无统计学意义（P＞0.05）。TBX2的阳性表达率:OSCC为87.72%，DOM为81.58%，NOM为26.67%。TBX2在OSCC、DOM两种组织中的表达较高，而TBX2在NOM相比较相对较低，OSCC、DOM与NOM的TBX2表达差异均有统计学意义 （P＜0.05），而OSCC、DOM比较差异无统计学意义 （P＞0.05）。见表 1。

表1 cFLIP和TBX2在OSCC、DOM及NOM蛋白中的表达（例）

2.2 cFLIP和TBX2在三种组织中的表达情况与OSCC临床之间的关系

本研究表明，OSCC的临床分期及淋巴结转移与cFLIP和TBX2表达程度有关，在这两个方面的表达差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 cFLIP、TBX2与OSCC临床特征关系（例）

2.3 OSCC、DOM和NOM三种组织中cFLIP mRNA、TBX2 mRNA的表达情况

OSCC、DOM两种组织中cFLIP mRNA的表达较高，而NOM的cFLIP mRNA较低，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）； 同时，OSCC、DOM 之间的 cFLIP mRNA表达差异有统计学意义 （P＜0.05）。在OSCC、DOM和NOM三种组织中TBX2 mRNA的表达:三种组织中，TBX2的表达由高到低依次是OSCC、DOM和NOM，其中OSCC与DOM、OSCC与NOM间的TBX2 mRNA的表达差异有统计学意义 （P＜0.05）；而DOM与NOM之间的TBX2 mRNA的表达差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。见表 3。

表3 OSCC、DOM和NOM三种组织中cFLIP mRNA、TBX2 mRNA 的表达情况（±s）

表3 OSCC、DOM和NOM三种组织中cFLIP mRNA、TBX2 mRNA 的表达情况（±s）

注:与 NOM 比较，aP ＜ 0.05；与 DOM 比较，bP ＜ 0.05；cFLIP:细胞型FLICE样抑制蛋白；TBX2:T-box转录因子；OSCC:口腔鳞状细胞癌；DOM:口腔黏膜上皮异常增生；NOM:正常口腔黏膜

组织类型 例数 cFLIP mRNA TBX2 mRNA OSCC DOM NOM 5738300.43±0.16ab 0.21±0.11a 0.09±0.070.51±0.20ab 0.26±0.170.19±0.11

2.4 cFLIP mRNA和TBX2 mRNA的表达与OSCC临床特征的关系

结果表明OSCC的临床分期及淋巴结转移与cFLIP mRNA和TBX2 mRNA的表达情况有关，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

2.5 cFLIP、TBX2在OSCC中的相关性

经过Spearman相关性分析发现，cFLIP、TBX2的表达呈正相关（r=0.768，P ＜ 0.05）。

表4 cFLIP mRNA和TBX2 mRNA的表达与OSCC临床特征的关系（±s）

表4 cFLIP mRNA和TBX2 mRNA的表达与OSCC临床特征的关系（±s）

注:与Ⅰ+Ⅱ期比较，*P ＜ 0.05；与无淋巴结转移比较，▲P ＜ 0.05；cFLIP:细胞型FLICE样抑制蛋白；TBX2:T-box转录因子；OSCC:口腔鳞状细胞癌

临床特征 cFLIP蛋白 P值 TBX2蛋白 P值年龄＜60岁≥60岁性别0.200.653.46±2.214.32±2.363.25±2.193.38±2.320.910.87男女3.98±2.294.57±2.103.47±1.893.31±1.16临床分期Ⅰ+Ⅱ期Ⅲ+Ⅳ期淋巴结转移情况0.010.032.34±2.064.53±2.17*2.18±1.674.08±2.36*0.020.04无有2.87±2.184.67±2.16▲3.09±2.114.51±2.21▲

3 讨论

世界卫生组织（WHO）明确定义恶性肿瘤是一种慢性病，而口腔颌面部最为常见的恶性肿瘤——鳞状细胞癌的形成也是一个长期的生物学过程，其特点是多步骤、多病灶性。因此我们可根据慢性病的特点，采取更合理、更有效的治疗措施。目前国内外高度重视恶性肿瘤的基础和临床研究，尤其是其发生发展、转化的研究；随着分子生物技术的飞速提高，大量的肿瘤标志物、癌基因被发现，应用于临床诊断、治疗之中，取得了较好的效果。常见的癌基因:Ras基因，抑癌基因:p53基因、RB基因等。研究表明:肿瘤发生时细胞的遗传物质——脱氧核糖核酸（DNA）产生突变，细胞的生长和分裂失衡，导致细胞的异常增生，凋亡失衡。在这个过程之中癌基因和抑癌基因发挥重要的作用。1997年Irmler发现了cFLIP，它是一种凋亡调控蛋白[5]，定位于人类染色体2q33-34，其蛋白的主要表达为cFLIPL和cFLIPS，前者的分子量较大，后者的较小；可以在人类等哺乳动物中存在，可以在正常组织中表达，例如肌肉、淋巴组织中等[6]。组织在炎症状态下cFLIP的表达水平会有所增加，促进单核巨噬细胞的趋化功能，清除坏死细胞及组织[7]；同时，炎症细胞能诱导cFLIP的表达水平增高，影响细胞凋亡。cFLIP可以抑制Fas及其他死亡受体介导的细胞凋亡（如 TNFR、DR3、DR6 等），诱导肿瘤发生。 而 Fas蛋白信号通路在肿瘤细胞的凋亡中发挥重要的作用。cFLIP 内含有死亡效应域（death effect domain，DED）；DED可以与死亡效应分子和Caspase-8结合，阻止了死亡 信号 复 合体 （death-induced signal complex，DISC）的形成，进而阻断了Fas蛋白所介导的细胞凋亡途径，抑制细胞凋亡，促进肿瘤细胞的增殖，形成肿瘤组织。通过小鼠实验表明cFLIP转基因肿瘤细胞能够躲避机体的免疫监视，且与Fas蛋白信号通路有关。研究表明，cFLIP在肠上皮癌[8]、膀胱上皮癌组织[9]、胃癌组织[10]及淋巴瘤组织[11-13]中表达显著增高，明显高于正常组织。本研究发现cFLIP及cFLIP mRNA在鳞癌组织中表达较高，明显高于NOM；另外，其表达情况与OSCC的临床分期及是否有淋巴结转移有关，而与年龄、性别之间的差异无关。有研究表明在Kaposi肉瘤中cFLIP的临床表达，提示了cFLIP在OSCC的发展中发挥一定的作用。T-box基因是一个重要的转录因子，TBX2是其重要的一员，在胚胎的发育形成过程中发挥至关重要的作用，同时还参与许多器官的形态发生，如肺、肾脏、乳腺间质、心脏、原肠形成以及黑色素细胞等[14-21]。研究表明TBX2在多种肿瘤中表达较高[22]，本研究与之相符。其机制可能是抑制p19arf蛋白的表达，破坏细胞的正常凋亡，导致细胞的过度增殖。也有人认为TBX2可以与Myc、Ras等癌基因发挥相互协同作用，促进肿瘤的发展；TBX2可能导致肿瘤细胞产生耐药性而维持肿瘤的生长。在相关性分析中，cFLIP、TBX2的表达呈正相关，提示两者之间可能互相促进OSCC的发生发展，印证了肿瘤的发生发展是多个基因共同调控的结果；但是具体机制需要进行深入的研究。

综上所述，我们可以考虑将cFLIP、TBX2作为治疗靶点，研究选用对两者敏感或针对性强的药物进行治疗，提高临床疗效。因此，对cFLIP、TBX2的深入研究有助于OSCC的早期诊断、有效治疗及预后评估。

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