脑缺血动物模型制备的研究进展

张旭生 刘黎青 王 媛

山东中医药大学基础医学院，山东济南 250355

脑缺血动物模型制备的研究进展

张旭生 刘黎青 王 媛

山东中医药大学基础医学院，山东济南 250355

缺血性脑血管病是临床上的常见病、多发病，是近年来医学临床基础研究的热点。脑缺血动物模型分为全脑性和局灶性两种，以局灶性脑缺血动物模型较为常用，后者的制备有开颅闭塞法、血栓法、线栓法等多种方法。其中线栓法在实验研究中应用最为广泛，自Koizumi首次制备该模型以来，医学研究人员不断对其进行改进，取得了良好的实验效果。另外，由于基因工程在技术上有着无可比拟的优势，因此可以大胆预测其将在以后的脑缺血动物模型制备方面发挥越来越重要的作用，能够更好地服务于临床实验研究。

脑缺血动物模型；制备；分类

缺血性脑血管病是内科疾病的常见病、多发病，占全部脑卒中的60%～80%[1]，严重威胁人类的健康。脑缺血动物模型在缺血性脑血管相关疾病的实验研究领域应用广泛。目前脑缺血模型主要分为全脑缺血模型和局灶性脑缺血模型两类，然而针对各种脑缺血模型的制作方法、适用范围、影响因素等方面没有全面的认知，这必将会影响脑缺血动物模型制备的进一步发展及更为广泛的应用。本研究将对脑缺血动物模型制备的研究进展做如下综述：

1 全脑缺血模型

全脑缺血是指绝大部分或全脑血流量的降低，制作该模型对脑缺血实验中的某些生理代谢研究有着重要作用[2]。此外，该模型稳定性高，病理改变充分，海马、丘脑、尾状核、皮质记忆区受损严重，可以模拟血管性痴呆的发病机制，也可用于神经保护药的评价研究[3]。此模型的造模方法多样，有心跳骤停、主动脉血流阻断、断头术、颈动脉气囊阻断大出血、低血压、低氧性缺血、双血管栓塞+低血压、四血管栓塞、三血管阻断、单向性颈动脉栓塞等[4]；其中比较常用的为四血管闭塞模型、双血管栓塞+低血压模型、三血管阻断缺血模型。

1.1 双血管栓塞+低血压模型

Eklof等[5]首先设计并制备该模型，通过阻断大鼠双侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）合并使用降压药物使其平均动脉血压降至50 mmHg（1 mmHg =0.133 kPa）左右，前脑血流量下降到基础血流量的15%以下，产生可逆性前脑缺血。此法具有手术难度低、可操作性强、模型死亡率低等特点。但是血压下降时易使其他重要器官的功能受到影响。武钊等[6]利用静脉留置针代替头皮针行静脉插管术，避免了由于针头过于锐利对血管造成的损伤；另外利用三通管代替传统的静脉穿刺来抽放血液，实现了对血液的自由抽放、回输及血压的监测，使得造模成功率达87.5%。

1.2 三血管阻断缺血模型

此模型在1985年由Kameyama等首先建立，大鼠麻醉后，做颈部正中切口，分离双侧CCA，除去枕骨腹侧面部分颅骨，电灼断扎基底动脉（basilar artery，BA），通过对双侧CCA的夹闭实现全脑缺血再灌注时间。这种造模方法成功率高，可通过阻断双侧CCA时间的长短控制脑缺血的程度。但此造模方法是在显微镜下进行的，BA在电灼断过程中易出血，手术难度大。

田鹤邨等[7]将此法改良，在直视下采用特制的动脉夹以控制BA的缺血-再灌注时间，使BA的损伤减轻。结果表明，在实验过程中，模型大鼠血压正常稳定，避免了由血压降低引起的其他重要脏器的再灌注压不足而导致的功能损害。

1.3 四血管闭塞模型

1979年由Pullsineli等[8]建立该模型。大鼠成功麻醉后，分离并暴露其双侧CCA和寰椎两侧横突孔，剥离两侧椎动脉（vertebral artery，VA）并用电凝器将其阻断。24 h后夹闭其双侧CCA，造成全脑缺血。此模型可根据实验要求，通过控制动脉夹的夹闭来实现脑缺血-再灌流，从而实现不同程度的脑缺血损伤。有学者在此基础上采用3阶段制作方法对其进行改良，第1阶段：分离双侧CCA；第2阶段：沿寰椎内斜向上的神经来寻找横突孔，分2次灼烧阻断双侧VA；第3阶段：24 h后夹闭CCA 10 min。此法可显著提高模型制作成功率和存活率[9]。

1.4 局灶性脑缺血模型

与全脑缺血模型比较而言，局灶性脑缺血模型的优势在于可对脑缺血特定部位进行干预，全身不良反应较小，与人类脑缺血发病情况更为相似，因此，此类模型应用也更广泛。局灶性脑缺血模型可以通过开颅闭塞法、血栓栓塞法、线栓法、化学刺激诱导血栓阻断法、内皮素诱导法和光化学诱导法等多种方法实现[10]。目前常用制备方法主要为前3种。

2 制备方法

2.1 开颅闭塞法

1981年Tamura等[11]建立该模型。首先经颞下部或眼眶入颅，阻断大脑中动脉（middle cerebral artery，MCA）及其分支，造成局灶性脑缺血。此法的可视性高，缺血效果好，术后神经功能评分普遍要好于线栓组，其术后生存时间也长于线栓组，可达2周，甚至更长[12]。但是开颅创伤大，对术者的手术技巧要求较高，尤其是MCA闭塞后无法实现再灌注，限制了其推广应用。2013年Yang等[13]采取氟烷吸入麻醉小鼠成功后，电凝其左侧MCA，同时阻断双侧颈内动脉（internal carotid artery，ICA）血流15 min的方法建立模型。此手术操作用时短，脑缺血后小鼠死亡率低。该模型可用于评估小鼠局灶性缺血性脑卒中、远期神经功能[14]。

2.2 血栓栓塞法

Kudo等[15]在1982年报道了该模型。此模型的优点在于利用大鼠自体血栓栓塞，更加接近人类脑缺血的实际情况；并且还可用来探索溶栓机制、评价溶栓药物疗效，具有其他模型无可替代的优势[16]。缺点在于存在栓子的走行和栓子是否阻塞期望血管不确定性等问题。2012年Durand等[17]在此模型基础上，经颞叶开颅，向MCA注射凝血酶，造成原位血栓，然后应用溶栓药物成功溶栓。开辟了血栓栓塞-溶栓这一新的脑缺血模型研究领域。

2.3 线栓法

线栓法造模因其可操作性高，缺血部位固定，并可按照实验要求控制缺血-再灌注时间，成为沿用至今的经典MCAO模型制备方法。1986年Koizumi等[18]首次报道该模型，将大鼠麻醉成功后，行颈部正中切口，玻璃分针分离其右侧CCA、颈外动脉（external carotid artery，ECA）、ICA，结扎ECA后，在CCA分叉处下方用眼科剪沿ICA方向做一楔形切口，将线栓插入切口，通过ICA到达MCA起始端感到阻力后，结扎CCA近心端，由此造模成功。若要进行再灌注，则由ECA插入线栓至MCA起始端，然后再将尼龙线往回抽到ECA处。

近年来，研究者们在线栓制备、麻醉、手术等环节加以改良优化，使该模型更加完备。

2.3.1 线栓影响因素

线栓的直径及插线深度、表面涂层及末端平滑度对栓塞效果影响较为显著。

2.3.1.1 线栓的直径及插线深度 关于线栓的直径，1989年Longa等[19]将4-0单尼龙线头端烫成光滑而膨大的球形，使其直径稍大于尼龙线本身替代Koizumi的线栓制备方法，此法优点是较为便捷，缺点在于没有考虑到因大鼠体重的不同而产生的血管直径差异。有研究表明，随着大鼠质量的增加，其线栓的直径也随之增加[20]。杜郭佳等[21]认为体重在250～300 g的大鼠，对手术的耐受性强，血管变异小，更适宜制备MCAO模型。

关于线栓的插线深度，文献报道不一。崔龙等[22]采用测量TC线[门齿根部前沿（T点）至CCA分叉点（C点）的连线]长来确定穿线深度，并给出公式：插线深度=1.0657×TC线长（mm）-2.6345，对预估插线深度有着很好的指导作用。

2.3.1.2 线栓涂层 刘运泉[23]在线栓头端覆以硅橡胶，然后用左旋多聚赖氨酸处理，此法避免了因线栓头端太锐利刺破动脉血管造成蛛网膜下腔出血，同时也增强了缺血的稳定性，保证了可靠的缺血效果。有研究表明，石蜡涂层线栓的建模成功率达100%，与裸露尼龙线栓相比，梗死效果更好，模型动物死亡率更低，是一种新型可靠的MCAO制备方法[24]。

2.3.2 手术方法

有学者在实验中采用颈部旁正中切口，不用微血管夹，改用线套法控制CCA以及ECA血流，松开套线恢复血液循环，避免空间小、血管夹夹闭困难及易出血等问题。此法视野暴露充分，易于分离肌肉和血管，出血少，对气管刺激小，总模型成功率为93.75%[22]。

冯珂等[25]在造模过程中发现，从CCA分出的ICA和ECA基本呈背腹分布，正面观察不宜辨别。经过进一步剥离才可确定在腹侧的是ECA，在背侧的是ICA。而孙念霞等[26]在结扎ICA断端外，线结外端用电刀阻断，并在插线时借助弯镊的力量使线栓沿CCA分叉处ICA血管的方向前行。此法可使线结不易脱落，插线成功率亦随之提高。

2.3.3 麻醉方法及麻醉剂的选择

常用的麻醉方法有气体麻醉和腹腔注射麻醉。气体麻醉优点是作用迅速，易于控制麻醉时间。缺点是需持续给药，且对呼吸道有一定的刺激作用。腹腔注射麻醉常用药物为戊巴比妥钠和水合氯醛。有学者对两者的麻醉效果进行对比研究，结果显示，戊巴比妥钠应用剂量较水合氯醛小，前者有效量与致死量更接近。且戊巴比妥水溶液不稳定，易分解。因此，就稳定性及安全性而言，腹腔注射麻醉剂优于水合氯醛[27-28]。

3 结语

随着临床基础医学的研究水平不断提高，脑缺血动物实验模型的造模方法在原有的基础上不断被加以改良和优化，使其能够更好地模拟出人类脑缺血时出现的病理生理变化，为临床医学工作者提供了有力的动物实验研究基础设施。目前，国外有学者在基因水平对实验动物加以筛选，培育出更加适用于实验研究的转基因大鼠。依据基因改造方法的不同可分为R169C、R90C、R142C和C428S 4种CADASIL大鼠模型，由于基因改造方法的差异，造成各个模型的基因表达水平不同[29-30]。在没有血-脑屏障破坏和血管结构改变的情况下，CADASIL大鼠模型易出现脑血管功能紊乱、循环障碍、脑血管内径变窄、肌源性反应减弱、自动调节能力减弱等表现[31]。但是目前的脑缺血动物模型仍受到动物体重、性别、麻醉方法、操作熟练程度、温度、栓子类型等诸多因素的影响。如何能够简便有效地制作出损伤小，成功率高，重复性好的脑缺血模型是亟待解决的问题。相信在不久的将来，通过广大学者不懈的努力和钻研，脑缺血动物模型的制备方法将更加完善，能够更好地服务于临床实验研究，为脑缺血疾病提供更多的理论依据。

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Research progress of preparation of cerebral ischemia animal model

ZHANG Xusheng LIU Liqing WANG Yuan
School of Basic Medicine,Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Shandong Province,Ji'nan 250355, China

Ischemic cerebrovascular disease is a common and frequently occurring disease.It is a recent hotspot in the field of clinical basic research.Animal model of cerebral ischemia is divided into global cerebral ischemia and focal cerebral ischemia,and the animal model focal cerebral ischemia is more commonly used.There are several methods for preparing the latter model,including occlusion method with craniotomy,thrombosis method,suture-occluded method etc.In which the suture method is the most widely used in experimental research.Since Koizumi prepared the model for the first time,medical researchers have continued to improve it and achieved good experimental results.Besides, since genetic engineering technology has unparalleled advantages,it is a bone predict that it will play an increasingly important role in the preparation of future animal models of cerebral ischemia,and it will better serve the clinical studies.

Cerebral ischemia animal model;Preparation;Classification

R743.9

A

1673-7210（2015）11（c）-0056-04

2015-08-14本文编辑：赵鲁枫）

国家自然科学基金项目（8140151367）。

张旭生（1984-），男，山东中医药大学2013级中西医结合专业在读硕士研究生；研究方向：中西医结合防治心脑疾病的实验及临床研究。

刘黎青（1961-），女，教授，硕士研究生导师；研究方向：中西医结合防治心脑疾病的实验及临床研究。