长非编码RNA ANRIL在肿瘤研究中的进展

邓怡君 王朝霞

1.南京医科大学第一临床医学院临床医学系，江苏南京 210029；2.南京医科大学第二附属医院肿瘤科，江苏南京 210011

长非编码RNA ANRIL在肿瘤研究中的进展

邓怡君1王朝霞2▲

1.南京医科大学第一临床医学院临床医学系，江苏南京 210029；2.南京医科大学第二附属医院肿瘤科，江苏南京 210011

长非编码RNA ANRIL基因是一种长3.8 kb的反义非编码RNA，在正常组织中表达丰富。ANRIL在多种恶性肿瘤组织，如肺癌、肝癌、黑色素瘤、白血病等中呈明显高表达，表现为原癌基因的功能，ANRIL可通过沉默p15、p16促进肿瘤增殖和生长，在肿瘤的发生、发展中具有重要作用，可作为一种新的生物标记，在肿瘤的诊断、治疗及预后预测中起关键作用。本文结合国内外最新报道对ANRIL在肿瘤研究中的进展进行综述。

ANRIL；肿瘤；原癌基因

在INK4位点的反义非编码RNA（antisense noncoding RNA in the INK4 locus，ANRIL），定位于染色体9p21.3区域，全长3.8 kb[1]。ANRIL在人的多种正常组织中表达，在卵巢中表达水平最高，肌肉中最低[2]。全基因组关联研究（genomewide association studies，GWAS）已经确定ANRIL为包括乳腺癌、鼻咽癌、胶质瘤等在内的多种癌症的风险位点[3]，因此被认为是原癌基因，其作为一种新型的长非编码RNA被认为有致癌作用。近年来，其抑癌功能及机制受到越来越多的关注，本研究就ANRIL基因与肿瘤的研究进展进行综述。

1 ANRIL的发现及作用机制

2007年，Pasmant等[2]利用逆转录酶-聚合酶链反应（reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR）在包括整个p15/CDKN2B-p16/CDKN2A-p14/ ARF基因簇在内的黑色素瘤缺失种系中首次发现并命名了ANRIL。ANRIL由RNA多聚酶Ⅱ转录，并被剪切成不同的异型体，包括一个长34.8 kb，名为p15AS的非剪切转录子。该基因含19个外显子，与p15/CDKN2B-p16/CDKN2A-p14/ARF基因簇反义方向转录形成长3834 bp的mRNA，三个重要的抑癌基因p15INK4b、p14ARF、p16INK4a在此进行转录[4]。ANRIL内含子1与p15/CDKN2B两个外显子重叠，其第一个外显子5'端位于p14/ARF基因转录起始位点上游300 bp。

ANRIL所在的基因簇在大约40%的人类肿瘤中存在着纯合性缺失和转录沉默。ANRIL能通过组蛋白甲基化修饰引起INK4b/ARF/INK4a基因的异常沉默而成为癌形成的始动因子[5]。ANRIL的作用机制主要有两个方面：一方面ANRIL可与多硫抑制复合物2（polycomb repressive complex-2，PRC2）的核心亚基SUZ12作用，招募PRC2，介导H3K27的三甲基化进而沉默p15的转录，促进肿瘤细胞增殖；ANRIL沉默可干扰与p15结合的SUZ12，促进p15的表达，抑制肿瘤细胞增殖[1]。另一方面ANRIL可与分子伴侣CBX7作用，CBX7是PRC1的亚单位，可招募PRC1到p16位点，通过组蛋白H3K27三甲基化沉默p16表达，促进肿瘤生长[6]。此外，Li等[4]研究显示，ANRIL参与DNA损伤应答，包括调节细胞周期、细胞凋亡和DNA修复。DNA损伤后，ANRIL受ATM-E2F1信号通路诱导[7]，ANRIL可提高肿瘤细胞对DNA损伤剂处理的敏感性。另外，ANRIL的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与肿瘤易感性相关[8]。

2 ANRIL与肿瘤

2.1 ANRIL与肺癌

Lin等[9]对87个非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）组织和3个NSCLC细胞系运用定量逆转录-聚合酶链反应（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测，结果发现，ANRIL在NSCLC组织和NSCLC细胞系中的表达高于癌旁组织和正常人支气管上皮细胞，较高表达ANRIL与临床分期和淋巴结转移有关；单因素和多因素分析表明，高表达ANRIL是NSCLC患者预后不良的指标之一。siRNA敲除ANRIL表达可抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。由此可见，ANRIL是NSCLC预后的潜在生物学标志，说明ANRIL的失调在NSCLC发生、发展过程中起重要作用。Nie等[7]研究还发现，ANRIL的表达水平与NSCLC肿瘤分期和肿瘤大小有显著相关性，且ANRIL高表达患者有相对较差的预后。

肖颖等[10]分别运用qRT-PCR和蛋白质印迹法检测RNA干扰前后细胞中ANRIL mRNA和下游相关基因表达变化，发现干扰ANRIL的表达能抑制NSCLC人肺鳞癌细胞系H520的生长，并上调CDKN2B、CDKN2A、ARF的mRNA和蛋白的表达。由此证实RNA干扰ANRIL能抑制NSCLC细胞的生长，ANRIL通过调控CDKN2B-CDKN2A-ARF基因簇起作用。

Kang等[11]研究发现，在NSCLC细胞系H460中ANRIL的表达水平受磷脂酶D（phospholipase D，PLD）抑制后增加至13.6倍。用siRNA敲除ANRIL，可抑制PLD抑制引起的细胞凋亡。由此可见，ANRIL是一种参与PLD抑制引起的抗肿瘤过程的长非编码RNA，将ANRIL合并入PLD抑制诱导的抗肿瘤信号转导网络，可成为控制肺癌发生的一种新型有效的治疗方法。

Timofeeva等[12]通过亚组分析显示，ANRIL内含子12中CDKN2B上游74 kb处，存在一个新的鳞状细胞癌SNP位点rs1333040，其与NSCLC遗传易感性有很强的关联，对不同类型肺癌发生、发展中生物差异的认识提供了进一步的证明。

Nie等[7]研究发现，ANRIL高表达患者NSCLC相对预后不良。NSCLC细胞功能缺失性实验发现，敲除ANRIL在体内外均能抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。此外，ANRIL不能抑制PC9细胞中p15的表达，但可通过KLF2和p21的转录沉默来抑制其表达。由此可见，ANRIL的表达与NSCLC患者生存期有关，在NSCLC的发展中起关键作用。

2.2 ANRIL与肝癌

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是引起死亡的主要癌症之一，死亡率仅次于胃癌和食道癌，严重威胁人类健康。肝癌的发病机制非常复杂。

Huang等[13]分析77例癌组织和正常组织中ANRIL的表达，运用qRT-PCR技术，发现ANRIL在肝癌组织中表达上调，ANRIL高表达与肿瘤大小和巴塞罗那分期显著相关；此外，HCC细胞的功能缺失性实验表明，敲除ANRIL在体内外均能抑制细胞增殖和侵袭，诱导细胞凋亡；研究还发现ANRIL结合PRC2，招募其至KLF2启动子区，从而抑制HCC细胞中KLF2因子转录。此外，ANRIL表达受SP1调控。由此可见，ANRIL作为生长调控者，可成为HCC潜在生物标志物以及潜在治疗靶点。

Hua等[14]通过qRT-PCR及siRNA干扰技术发现，ANRIL在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织；ANRIL表达与HCC患者组织学分级、TNM分期相关；此外，ANRIL高表达的HCC患者整体生存期显著较短；多因素分析表明，ANRIL高表达是预后不良的独立预测因素；体外实验显示，ANRIL低表达能抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。因此ANRIL可以作为一种有效的肝癌临床生物标志物以及潜在治疗靶点。

2.3 ANRIL与前列腺癌

Yap等[15]运用qRT-PCR技术，分析若干前列腺组织样本中ANRIL表达，结果发现，相对于正常前列腺上皮细胞和其他癌组织，前列腺上皮内瘤组织中ANRIL表达升高，且无法在正常前列腺细胞中检测到ANRIL。此外，PC3细胞中INK4a和ARF的启动子区域附近CBX7表达较IMR90二倍体成纤维细胞高，这与ANRIL相一致。由此可见，CBX7和ANRIL在前列腺癌中表达均上调，且两者在肿瘤发展过程中呈相关性。刘超等[6]研究显示，CBX7和ANRIL在人类前列腺癌高表达且伴有INK4a转录产物的减少[16]，与肿瘤的发展过程呈相关性，是潜在的肿瘤标志物。

2.4 ANRIL与结直肠癌

王维佳[17]研究发现，与癌旁正常组织比较，ANRIL在结直肠癌组织中表达升高。古松钢等[18]通过免疫组化SP法和qRT-PCR技术对结直肠癌样本中p15和ANRIL表达进行检测，结果显示，p15基因在癌组织中的表达量明显低于癌旁正常组织，ANRIL明显高于癌旁正常组织。发生机制是由于ANRIL基因过表达，p15在组织中表达缺失，从而使p15基因失去了对癌细胞的抑制作用，引发肿瘤。因此，ANRIL和p15的表达与结直肠癌的发生、发展密切相关，可为结直肠癌的临床治疗寻找新的靶点提供一定的实验基础。

2.5 ANRIL与神经纤维瘤

Pasmant等[19]使用高分辨率阵列对比基因组杂交技术从18例Ⅰ型神经纤维瘤 （neurofibromatosis type 1，NF1）患者中获得22个丛状神经纤维瘤（plexiform neurofibroma，PNF）组织，结果显示，在NF1相关的PNF中，9p21.3缺失（包括CDKN2A/B-ANRIL位点）是唯一的循环体细胞改变。此外，ANRIL上的单核苷酸多态性rs2151280与NF1患者的PNF数量相关。运用qTR-PCR技术结果显示，rs2151280的T等位基因与ANRIL转录水平下降显著相关，表明ANRIL表达调控介导PNF敏感性。NF1上的ANRIL作为修饰基因，可为PNF尤其是NF的分子机制提供线索。

Vanneste等[20]研究发现，多发性皮肤神经纤维瘤与两大基因家族有关。第一个家族中，受影响个体均在内含子1的剪接受体位点有一个杂合子G→C突变，这引起CDKN2A基因外显子2的跳读。而在第二家族中受影响个体存在整个CDKN2A/CDKN2B/ANRIL位点缺失。对多点活检证实的皮肤神经纤维瘤和单发脊髓神经纤维瘤中研究发现CDKN2A外显子2中有一段14个核苷酸的缺失。这为p14、p16和/或ANRIL具体参与NF发病机制提供了进一步依据。

2.6 ANRIL与白血病

Iacobucci等[21]对149例包括费城染色体阳性，急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）和急性髓系白血病（acute myelocytic leukemia，AML）在内的白血病患者和183名健康对照实施病例对照研究，对横跨MTAP、CDKN2A/B、CDKN2BAS位点以及相关基因间区的23个SNP进行分型。结果显示，编码ANRIL的 CDKN2BAS位点上的rs564398与ALL显著相关，其风险模式与疾病易感性的过显模型和比值比为2相一致。Li等[4]研究显示，一些SNP可能改变ANRIL的表达和/或剪接，其可能有助于INK4b-ARF-INK4a基因表达的变化。由此可见，一些ANRIL多态性有助于其影响CDKN2A/B表达谱改变的转录变化，从而加速异常增殖，最终增加ALL易感性[21]。

Chen等[22]通过全外显子组和全基因组测序技术研究发现，MHH-CALL-2细胞系内9号染色体上跨度约372 kb的区域存在标测序列片段的纯合性缺失，影响编码ANRIL的基因位点。这一缺失变异增强了MHH-CALL-2在ALL产生发展中的作用如细胞周期调节失控，细胞增殖增加，DNA修复缺失，细胞死亡逃避，表观基因调控紊乱等。完全外显的大量有害的纯合突变最有可能导致近单倍体ALL预后不良。

2.7 ANRIL与其他肿瘤

Chen等[23]对人体食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）组织和癌旁组织的ANRIL表达检测发现，与癌旁组织相比，ESCC组织中的ANRIL表达水平明显升高。此外，抑制ANRIL可增加ESCC细胞系中p15INK4b和转化生长因子 β1（transforming growth factor β1，TGFβ1）的表达，ANRIL耗尽可抑制细胞增殖。由此可见，ANRIL在ESCC发生、发展中通过TGFβ1信号通路产生作用。

Cunnington等[8]研究发现，高风险SNP顺式影响ANRIL表达。神经胶质瘤的风险等位基因 SNP rs1063192-C与ANRIL表达升高高度相关。染色体9p21区SNP与神经胶质瘤和恶性黑色素瘤易感性相关。

Sarkar等[24]研究显示，ANRIL的不同外显子在黑素瘤细胞株中表达不同，有证据表明这些细胞中存在环状ANRIL。单核苷酸变体rs1011970（有19个外显子的ANRIL亚型的内含子9）与黑色素瘤风险有关，但仅限于变体等位基因纯合子。此外，miR-449a在黑色素瘤老年患者中显著下调，表明ANRIL可能通过类似过程促进黑色素瘤的进展。鉴于CDKN2A作为肿瘤抑制因子且是在家族性黑色素瘤病例中被发现的，因此ANRIL在黑色素瘤的作用需要澄清。CDKN2A的T等位基因多态性rs3088440携带子（CDKN2A 3' UTR）存在黑色素瘤高风险。这一变体标记6个SNPs，其中3被发现位于基因间区，其他分别位于ANRIL内含子3，CDKN2A内含子1和CDKN2B的3'UTR。因此，ANRIL可作为潜在治疗靶点以及潜在黑色素瘤早期诊断标志。Cunnington等[8]研究发现，黑色素瘤的风险变异体SNP rs1011970-T与ANRIL表达降低相关，表明高风险SNP调节ANRIL与肿瘤易感性相关。

Zhang等[25]研究显示，ANRIL在胃癌（gastric carcinoma，GC）组织中大多上调。ANRIL高表达与GC的TNM分期和肿瘤大小显著相关。多变量分析显示，ANRIL可作为生存期预测因素。敲除ANRIL在体内外均能显著抑制细胞增殖。研究还表明，ANRIL结合PRC2，可抑制Trans（控制靶点——mTOR和CDK6/ E2F1通路）中miR-99a/miR-449a，从而引起E2F1释放，依赖ATM诱导ANRIL高表达，形成正反馈循环，促进GC细胞增殖。ANRIL作为生长调控基因，可作为潜在预后标志物和GC治疗的新靶点。

Qiu等[26]研究发现，ANRIL水平在浆液性卵巢癌（serous ovarian cancer，SOC）组织中明显上调，与SOC的FIGO分期、组织学分级、淋巴结转移、预后不良高度相关。多因素分析显示，ANRIL是预测SOC生存率的独立预后因素。研究还发现，ANRIL在SK-OV-3.ip1细胞和HO8910-PM细胞内均高表达，siRNA介导的ANRIL沉默抑制细胞迁移和侵袭。此外，MET和MMP3是SOC细胞迁移、侵袭过程中ANRIL关键的下游基因。ANRIL在肿瘤浸润转移中起重要作用，因此可成为潜在生物标志物及潜在治疗靶点。

Pasmant等[27]通过GWAS发现，ANRIL是胶质瘤及基底细胞癌的危险位点。

徐飞岳等[28]研究发现ANRIL在胰腺癌中高表达。

3 小结

综上所述，ANRIL在多种肿瘤中均为高表达，发挥着原癌基因的作用。ANRIL高表达与肿瘤的发生、发展、转移及预后密切相关。ANRIL能促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，降低患者生存率，还可作为肿瘤预后不良的指标，有望成为肿瘤治疗的新靶点。目前对于ANRIL的研究还未完全成熟，更多的生物学功能及其机制等待揭晓。

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Advancement of long non-coding RNA ANRIL in tumor research

DENG Yijun1WANG Zhaoχia2▲

1.Department of Clinical Medicine,the First Clinical Medical College of Nanjing Medical University,Jiangsu Province, Nanjing 210029,China;2.Department of Oncology,the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Jiangsu Province,Nanjing 210011,China

Long non-coding RNA ANRIL is an antisense non-coding RNA with a 3.8 kb length.ANRIL is found enriched in normal tissues.Recent studies show that high expression of ANRIL has been found in various human malignancies such as NSCLC,HCC and melanoma acting as oncogene.ANRIL is involved in tumor proliferation and growth through silencing p15 and p16,which plays an important role in the development and progression of tumors.ANRIL may become a new biological marker and plays an important role in the process of diagnosis,therapy and prognosis.In this view,we summarize the latest progress,both domestic and overseas,on the advancement of ANRIL in tumor research.

ANRIL;Tumor;Oncogene

R73

A

1673-7210（2015）11（c）-0060-05

2015-08-25本文编辑：李亚聪）

国家自然科学基金项目（81472198）；江苏省省级条件建设与民生科技专项资金项目（BL2014096）；江苏省医学重点人才基金项目（RC201180）。

▲通讯作者