载药超声微泡研究进展

杨世艳，何 兵，李明星

（1.泸州医学院临床医学院，四川 泸州 646000；2.泸州医学院附属中医医院超声影像科，四川 泸州 646000；3.泸州医学院附属医院超声诊断科，四川 泸州 646000）

载药超声微泡研究进展

杨世艳1，2，何 兵1，李明星3

（1.泸州医学院临床医学院，四川 泸州 646000；2.泸州医学院附属中医医院超声影像科，四川 泸州 646000；3.泸州医学院附属医院超声诊断科，四川 泸州 646000）

载药超声微泡的靶向治疗是当前医药领域中的研究热点。载药微泡进入血液循环后可迅速聚集于靶组织，在超声作用下微泡产生的空化效应和声孔效应，能使其有效穿透血管内皮屏障，定点释放内部包裹的药物，使局部浓度大大增高，达到靶向治疗目的。本文就载药超声微泡的分类、特点、作用机制、制备及应用等做一简要综述。

微气泡；超声检查；造影剂；药物载体

超声微泡是指一类直径在1～8μm、内含气体、外部包有一层膜的微气泡。自1968年Gramiak等［1］首次将自制的微泡进行M型超声心动图检查以来，超声微泡对比剂已有40多年的应用历史。近年，国内外已相继成功研制蛋白类、表面活性剂类、脂质类、多聚体类等多种包膜的超声微泡。研究［2］表明，超声微泡能有效增强心、肝、脾、肾、脑等实质性器官的二维灰阶成像和彩色多普勒血流信号，明显提高超声诊断的特异性和敏感性。随着医药生物技术的迅猛发展以及超声微泡对比剂研究的不断深入，研究发现超声微泡不仅是一种良好的超声显像对比剂，而且是一种重要的药物传输载体［3］。国内外已针对载药超声微泡的研究取得了很多重要进展，本文就目前载药超声微泡的分类、特点、作用机制、制备及应用做一简述和探讨。

1 超声微泡的分类

1.1 超声微泡根据其成膜材料的不同，可分为以下几类

1.1.1 脂质体类 脂质体类微泡壳膜材料主要为磷脂类：二棕榈酰磷酯酰胆碱（DPPC）、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）、二花生酰基磷脂酰胆碱（DAPC）等［4］，其粒径很容易做到纳米级别，极具穿透力，能穿透血管内皮间隙，到达血管外的组织及细胞，实现超声靶向成像和治疗。脂质体类微泡具有稳定性好、使用安全、易于靶向修饰、造影效果好、可作药物的载体及成本低廉、易于商品化等优势，是一种理想的成膜材料。但存在声学特性不易控制，声衰减显像较明显，有效增强显影时间较短等问题。杨健等［5］制备了载多烯紫杉醇的脂质超声微泡，并检测了其体外寻靶能力。有学者［6］发现，将表面活性剂、聚合物成分高渗糖类或醇类加到脂质类微泡成膜材料中，以冷冻干燥与声振处理相结合，制备的微泡浓度和粒径均较理想，有效增强显影时间超过30min，不但提高了微泡产率、延长有效增强显影时间，同时还降低了成本。

1.1.2 蛋白类 蛋白类微泡多以人血白蛋白为其主要囊材，其粒径为3～7μm，能随血流分布至全身，静脉注射微量便可显示良好造影效果。但存在稳定性差、价格昂贵、尺寸较大、产生异种蛋白免疫反应及产量较少等问题。若加入一些表面修饰物，如糖类物质，形成糖蛋白或蛋白聚糖，能提高微泡产率、稳定性及耐热性，降低成本，改善其不足，并有利于常温保存和运输。杜永峰等［7］通过超声空化法制备出含蔗糖白蛋白微泡，发现当蔗糖浓度达到40%，微泡半衰期可延长到50 d以上，96%的微泡尺寸分布在2～5μm，4℃下保存半年微泡数量和尺寸无明显变化。

1.1.3 表面活性剂类 表面活性剂由于本身具有良好的起泡性，因而广泛用于微泡的制备研究中。常用的是非离子表面活性剂Tween及Span系列，其能与多种类型的表面活性剂联用。这类微泡虽然浓度大小适宜，但存在不稳定、存放时间短、不宜包裹分子量小的气体等缺点。王仁奎［8］以Span60和Tween80为成膜材料，以氮气为内部填充气体，采用超声空化，所制备包裹诺氟沙星磁靶向微泡平均粒径为2.5μm，向高脂喂养的兔子注入靶向载药微泡能够准确诊断腹主动脉中脂肪斑块的位置，并在超声指导下实现药物的定点释放。

1.1.4 多聚体类 多聚体类微泡多以合成的聚合物或天然大分子，如聚乳酸—羟基乙酸共聚物（PLGA）、聚乙二醇（PEG）、多聚糖等为壳膜材料，成膜微泡的平均粒径为1～5μm。此类微泡外壳较厚，也比较硬，抗压性较好，造影持续时间较长。但需要较高声强的超声脉冲才引起微泡的非线性振动或破裂，从而对比成像，易造成细胞溶解、毛细血管破裂、局部渗出、出血或黏膜淤血等生物学效应［9］。 李奇林等［10］采用复乳法制备乳酸羟基乙酸共聚物微泡，所制备的微泡平均粒径1.2μm，常温干燥储存10周后，浓度、粒径及pH值均无明显变化。

1.2 超声微泡根据靶向性质不同分为以下2类：①被动靶向，也称作自然靶向，是载药微泡进入体内被肝脾中的巨噬细胞在调理素的协同作用下将其作为外界异物截留并清理与吞噬而产生的体内分布特征［11］。微泡外壳本身的化学和电荷特性也可使微泡滞留于病灶部位，从而在一定程度上使微泡具备一定的靶向特性。但该机制缺乏高度的靶向性和特异性，结合能力低，因此限制了其在靶向对比超声成像技术及药物靶向运输中的应用。②主动靶向，通过对超声微泡的外壳进行特殊处理，在微泡表面连接上特异的抗体或配体（多糖、多肽等）［12-13］，使微泡能不需要白细胞的介导，直接结合到病灶部位细胞所表达的特异性抗原或受体上，即可达到靶向显影、靶向输药及靶向治疗的目的。此外，利用分子桥的作用，将疾病相关的单克隆抗体与微泡相结合，从而间接地使微泡与病变部位表达的相关抗原结合，也可达到靶向目的。由于这一机制具有高度靶向性和特异性，同时又避免了吞噬细胞对微泡的破坏，因此，成为研制和开发无创性靶向超声微泡的主要方式。

2 载药超声微泡的特点

在载药超声微泡中，应用最为广泛的是脂质体类微泡。作为药物载体，微泡结合超声技术可望实现局部定位给药、保护药物活性基团、延长药物半衰期、延缓药物在体内的释放、减少给药次数和剂量，降低药物不良反应的目的［14］。不同包膜的载药微泡具有各自的特点，与白蛋白类、表面活性剂类及多聚体类微泡相比，脂质体类微泡具有更多优势，原因在于脂质体类微泡具有以下特性：①靶向性。超声微泡经不同的方法处理后，能选择性地靶向于特定器官，达到靶向给药治疗的目的。②提高靶组织药物浓度。将具有较大不良反应的药物如阿霉素包裹于超声微泡中，在靶器官局部释放可达到提高靶组织药物浓度、延缓药物释放、减少剂量、减少给药次数，以及提高药物疗效的目的。③使用安全。脂质体微泡的外壳磷脂膜在体内可以生物降解，对人体无毒无害。④稳定性好。脂质体类微泡化学性质比较稳定，常温下可保存数月不变，适用于工业化生产。⑤显著增强超声造影效果。类脂类成分形成膜后在水介质中会形成液晶双层，其分子几何形状中疏水和亲水部分大小接近，研究发现这种含有脂质体类的微泡能显著增强造影效果［2］。⑥传输效率高。脂质体微泡因其壳的固有特性，还可以在其表面装配不同的抗体或配体，实现靶向显影与治疗，从而能有效提高药物的传输效率。另外，微泡破裂时产生强烈的冲击波和高速微射流在血管壁或生物屏障上形成暂时性的微孔，也可以增强药物传输。⑦降低机体免疫反应。大部分药物，如蛋白类、多肽类药物在给药后，由于机体的排斥可能引起免疫排斥反应，若将这些药物包裹于超声微泡中后再给药，可使机体免疫排斥反应降低到最低限度，并使药物的生物适应性及稳定性达到最佳。

3 超声微泡的作用机制

3.1 空化效应 在超声波的作用下，微泡可向血管壁移动，增加对血管的黏附力，微泡在超声波的作用下会先后产生“扩大—收缩—崩溃”的动力学过程，称为超声空化效应。微泡在低声压下产生对称性的压缩和膨胀而不发生破裂，微泡沿其平均半径做周期非线性振荡运动，在振动过程中引发辐射压力和微射流，从而影响其周围的细胞、生物大分子等，并产生一定的生物学效应，称为稳态空化。微泡在高声压下急剧膨胀和收缩，最终导致微泡破裂，使声能瞬间大量释放，并产生巨大的瞬时压力和强烈的冲击波及微射流，在周围微小空间内形成高温、高压环境，引起细胞结构和功能的改变、微生物和机体的损伤和破坏［15］，此称瞬态空化。

3.2 声孔效应 声孔效应是超声微泡破坏后实现靶向释药，进而实现诊断与治疗的主要机制。声孔效应是指微泡崩溃瞬间释放的能量在内皮细胞膜上形成冲击波及微射流，产生巨大的切应力，从而击穿周围组织的细胞壁，产生可逆或不可逆的小孔，同时增加了细胞膜的通透性。这种膜通透性的增加与膜上出现暂时性开放小孔有关，并与微泡破坏过程中产生自由基并伴随活性氧族生成有关，还可能与空化时产生的热量作用于细胞的磷脂双分子层，使其流动性改变有关［16］。如果这种小孔属于可逆的非致死性声孔，则在其开放的瞬间可使细胞外的药物进入细胞内，并达到靶向显影与治疗的目的。

4 载药超声微泡的制备

制备靶向脂质超声微泡，关键是让微泡在结合药物的同时不影响微泡的声学特性。超声微泡载药的方法主要有以下方式：①药物经静电吸附作用直接黏附在微泡的外壳膜上，如带负电荷基团的药物易黏附于带正电荷的脂质体微泡表面，其在血液循环中不稳定；②非共价结合在微泡表面，如某些药物能以静电吸附方式非共价键结合在微泡表面；③将药物嵌入微泡外壳膜双分子层中间，这种结构能增加微泡的稳定性；④有些药物可以和气体一起包被在微泡内部，这种方式不影响微泡表面结合靶向配体；⑤疏水性药物可以混合在脂质体微泡油脂层内，会形成一层薄膜包绕在微泡内部，其外包被着一层稳定的膜，这种结合方式可连接抗体或配体用于靶向释药。目前，国内外常用的载药超声微泡的制备有以下几种方法：机械振荡法、声振空化法、高压均质法、薄膜水化法、冷冻干燥法、喷雾干燥法［17］。

5 应用

5.1 肿瘤治疗 靶向载药微泡经静脉注入血液后，可通过血液循环迅速聚集于肿瘤靶器官，在超声波的动态监测下，可直观监测微泡到达肿瘤靶组织的情况。同时利用一定强度的超声在肿瘤靶区的体表定位辐照，超声介导微泡的空化效应会导致微泡在肿瘤靶组织内破裂，微泡所携带的药物会迅速释放到肿瘤靶区，实现靶向释药的目的。另外，超声介导微泡破裂产生的空化效应和声孔效应，不但可使供应肿瘤的微血管栓塞，阻断肿瘤供血，而且可直接损伤肿瘤细胞，促使肿瘤细胞发生结构和功能的改变，导致肿瘤细胞凋亡，更能增加药物的吸收，提高药物的疗效。康娟等［18-19］研究发现，载多西紫杉醇脂质微泡，在超声波的作用下能在兔肝内定位释放，不但能抑制兔VX2肝癌的微血管生成，还能延缓兔VX2肝癌的增殖，促进其凋亡。

5.2 溶栓治疗 携带溶栓药物的微泡在高能低频超声作用下产生的瞬时空化效应可使血栓易于软化、溶解［20］，它使溶栓剂易于向血栓内部渗透。将超声微泡作为溶栓药物的传递系统，能较好地监控治疗过程中的溶栓和出血现象，大大降低治疗风险，解决了靶向载药和出血监控等瓶颈问题。Wu等［21］在体外实验中将尿激酶结合在MRX-408微泡的外壳上，当微泡与血栓表面黏附后，利用超声波照射使微泡破裂，释放出尿激酶，从而使血栓软化，加速溶解。

5.3 炎症治疗 在炎症病变区，血管内皮细胞高表达整合素类分子，白细胞聚集并表达特异性分子，通过制备靶向这些分子的超声微泡，不仅能使炎症靶向显影，评价炎症的严重程度，而且可利用微泡携带抗炎药物靶向传输至炎症部位，再给予超声辐照，通过超声对微泡的空化效应破坏微泡，使得药物在病变局部释放出来，不仅能提高药物在病变局部的浓度，提高治疗效果，而且还可减少药物的不良反应。Villanueva等［22］将抗ICAM-1抗体共价连接在全氟丁烷微泡的脂质外壳上，这种微泡可选择性结合于表达黏附分子的活化内皮细胞，使炎症的靶向显影具有更高的针对性和选择性。魏武然等［23］研究发现，超声微泡可有效促进大鼠前列腺局部对舍尼通的吸收，对非细菌性前列腺炎的治疗起明显促进作用。

5.4 其他疾病的治疗 载药超声微泡除了应用于常见的肿瘤、血栓及炎症的治疗外，还能应用于多种疾病的治疗。田新桥等［24］研究发现，超声微泡靶向递送酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）可有效改善糖尿病心肌病大鼠的左心室功能。金琳等［25］研究发现，超声微泡介导雷帕霉素可抑制兔腹主动脉球囊损伤术后新生内膜增生及增高p27、降低VEGF表达。

6 问题及展望

利用超声微泡作为抗肿瘤药物的载体，具有高载药量、稳定性较好、靶向性好、无免疫原性、可修饰、相对无创、同时还可增加疗效及减轻不良反应等诸多优点，在肿瘤的诊断和治疗方面有很大的发展潜力。但在应用微泡传送抗肿瘤药物时，仍然存在一些有待研究的问题及难点：①提高载药微泡的载药量和包封率。②提高微泡的稳定性和显影时间。③寻找能主动识别肿瘤特异性标志物的配体，并使其与微泡偶联，以进一步提高其靶向性。④安全性有待提高，超声在破坏微泡引起细胞膜穿透性增强的同时也有可能导致周围正常细胞和组织的损伤［26］。这通常是由于相对较高的微泡浓度、较长时间的超声脉冲和较高的超声强度导致的。另外，成膜材料的安全性研究也有待提高，如Tween80，虽然常用于制备表面活性剂类微泡以及用于中药注射剂的增溶等，但研究表明［27］经静脉注射会引起溶血、血压下降及过敏反应，目前已禁用于静脉注射。⑤超声微泡的部分制备方法，仅适用于实验，无法满足工业化生产。

随着国内外对载药超声微泡研究的不断深入及医药生物技术的迅猛发展，超声微泡在重大疾病治疗方面必将具有广阔的应用前景。

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2014-06-06）

10.3969/j.issn.1672-0512.2015.01.035

泸州市—泸州医学院联合基金（2013LZLY-K61）；泸州市2011年指导性项目（泸市科［2012］177号）；泸州医学院附属中医医院院内基金（2011-342）；泸州医学院2010年青年基金（泸医院［2010］108号）。

杨世艳，E-mail：lyysy2010@126.com。