促红细胞生成素在脑缺血性损伤中的研究进展

王晓芳，王 妮，胡晓飞综述，吕晓红审校

促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)曾被认为是由肾脏和肝脏分泌的一种激素样物质，用于促进红细胞生成。近些年来，越来越多的研究发现了EPO 的神经保护作用，本文主要对EPO 在脑缺血性损伤中的作用及作用机制做一综述。

1 EPO 在脑缺血性损伤中的保护作用

1.1 内源性EPO 在脑缺血性损伤中的保护作用 大量动物实验和体外研究表明，内源性EPO 参与了多种因素对脑缺血性损伤的保护作用。Konstantin Prass 等将Sv129/J 小鼠在8%O2中进行不同时间缺氧预适应(hypoxia preconditioning，HP)，之后结扎一侧大脑中动脉，不同的时间间隔后给予缺血后再灌注，最后比较大脑皮质、海马区域的脑梗死面积，并分别用反转录酶-聚合酶链锁反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)、电泳迁移率变动分析检测EPO 基因的表达，结果表明在脑缺血48 h 或72 h 前给予3～5 h 的HP，可使短暂局部脑缺血后脑梗死面积明显减小，并且在HP60 min 后EPO mRNA 增加了7 倍，注射可溶性的促红细胞生成素受体(erythropoietin receptor，EPOR)可减少40%HP 的保护作用，这说明了在HP 对脑缺性损伤的保护作用中内源性EPO 是重要的中介物［1］。另有研究证明了EPO 也参与了缺氧后适应对脑缺血性损伤的保护作用，Claire Leconte 等在体内和体外脑缺血模型中，缺血一段时间后给予慢性间断性缺氧，后发现小鼠脑梗死面积、原代神经元的存活率均较对照组明显改善，同时在体外研究中还发现EPO mRNA 水平也是升高的，而注射可溶性的EPOR 可以部分抵消缺氧后适应对脑缺血性损伤的保护作用，这提示了内源性EPO 也参与了这种保护作用［2］。此外，近年来还有研究证实了银杏内酯B、马齿苋乙醇提取物对脑缺血性损伤的保护作用也是部分依赖于稳定低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)后促进生成的内源性EPO［3，4］。

1.2 外源性EPO 在脑缺血性损伤中的保护作用 随着内源性EPO 对脑缺血性损伤的保护作用被发现，许多研究学者将外源性EPO 应用于脑缺血性损伤中，且同样发现它的神经保护作用。Hralova M 等预先向大鼠腹腔内注射EPO 5000 U/Kg，10 min 后局部注射内皮素造成局部脑缺血，然后通过局部运动功能描述及水迷宫实验比较局灶性脑缺血1 w前和3 w 后的运动功能和认知功能，结果发现rhEPO 预适应可以明显改善局部脑缺血后的运动和认知功能［5］。在体外研究中，rhEPO 预处理的保护作用也被证实。将原代皮质神经元在暴露于致死性缺氧之前给予24 h rhEPO 预处理，能够明显减少神经细胞凋亡数量［6］。除此以外，EPO 的后处理也在脑缺血性损伤中被证明有保护作用。在SD 大鼠局部脑缺血模型中，再灌注初期开始给予rhEPO 治疗，结果发现在缺血后2 h、再灌注24 h 时治疗组中大鼠的脑梗死面积、脑水肿均显著减轻，神经功能缺损也得到了改善［7］。综上可见外源性EPO 对于预防和治疗缺血性脑血管病的有效性。

2 EPO 在脑缺血性损伤中的保护机制

2.1 参与EPO 在脑缺血性损伤中的保护作用的信号传导通路 一项发表于“Nature”的研究指出EPO 作用于EPOR激活JAK2(janus activating kinase 2，JAK2)，使核因子-kappaB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)抑制物IκB 磷酸化后与NFκB 分离，即激活NF-κB，后者进入细胞核，与DNA 片段结合，从而介导抗细胞凋亡基因的表达，抵抗N-甲基-D-天门冬氨酸(N Methyl D Aspartate，NMDA)或是NO 对神经元的毒性作用;同时研究结果也强调了JAK2、NF-κB 的激活对于EPO 介导的神经保护作用的必要性，但需注意的是，只有神经元中的NF-κB 平稳而持久的激活才可以发挥神经保护作用，在胶质细胞中或是急促的激活却会产生不良作用［8］。之后另一研究对此作出了补充，EPO 作用于EPOR 后同样激活JAK2，不同的是，JAK2 激活磷脂酰肌醇-3-羟激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K)，而后者又激活蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)，使bcl-2(B-cell lymphoma-2，bcl-2)蛋白家族中促细胞凋亡蛋白BAD 磷酸化后与抑制细胞凋亡蛋白bcl-XL 或bcl-2 分离，即激活了Bcl-xL 或bcl-2，而bcl-2 被普遍认为能够通过保护线粒体膜的完整性和抑制线粒体细胞色素C 的释放抑制细胞凋亡，bcl-xL 同样也具有抗细胞凋亡作用［9］。另外JAK-STAT 通路也被一些研究证明参与了EPO 对神经元的保护作用。信号转导和转录活化因子(signal transducers and activators of transcription，STAT)家族包括7种转录因子，脑缺血再灌注损伤本身可以激活STAT1、STAT3，其中被激活的STAT1 能够通过转录因子依赖和非依赖的途径促进神经元的凋亡，而被激活的STAT3 是发挥神经保护作用的，EPO 则是通过促进激活JAK2/STAT3 来发挥保护作用的，即EPO 作用于EPOR 激活JAK2 后，使STAT3 磷酸化，后者进入细胞核，调控目标基因的转录，从而提高神经元的存活能力，促进组织重塑，抑制细胞凋亡［10～12］。进一步的研究还证明了脑缺血性损伤中STAT3 的激活可以在一定程度上抑制STAT1 的激活，原因可能是EPO 激活STAT3 后，使细胞因子信号转导抑制分子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)表达上调，从而进一步抑制了STAT1 的表达，也可能是STAT1、STAT3 竞争同一受体的作用［11］;另外JAK2激活STAT3 后，还可以上调基质金属蛋白酶抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)的表达，而在体外神经生长因子(nerve growth factor，NGF)诱导PC12 细胞系分化神经元中和动物模型中都证明了TIMP-1 参与了EPO 对脑缺血损伤保护作用，并且伴随着TIMP-1 的上调还发现了基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的下调［13］。

2.2 脑缺血性损伤中EPO 对于血脑屏障的保护作用近些年来，一些研究学者还发现了在脑缺血性损伤中EPO对血脑屏障的保护作用。Ratilal BO 等先用rhEPO 预处理Wistar 大鼠10 min 后再结扎右侧大脑中动脉60min，在再灌注24 h 时观察到脑梗死面积、脑梗死区退化的神经元数量、磷酸化Akt 的表达和定位与对照组相比未见明显差别，但脑水肿、神经功能缺损的严重程度、血管周围水肿却是减轻的，这提示了此时EPO 是通过对血脑屏障的保护间接发挥作用的，而不是通过抗神经元凋亡作用来直接发挥作用的［14］。有研究者对其机制进行了探索，发现rhEPO 预处理可能通过下调肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNFα)、NFκB 亚基p65 使紧密连接相关蛋白1(ZO-1)、封闭蛋白-5(Clandin-5)、闭合蛋白(Occludin)的表达增多，从而维持紧密连接的完整性，降低血脑屏障的通透性［15］。

2.3 脑缺血性损伤中EPO 增加血管生成反应 另外，在脑缺血性损伤中EPO 对于血管生成的作用也在受到关注。Young Jae Kim 等在SD 大鼠脑缺血再灌注损伤后给予连续4 d rhEPO 治疗，14 d 后通过免疫组化技术观察到脉络丛和大脑血管中的内皮祖细胞生成增加，说明了EPO 可以促进血管生成，并且该研究还发现rhEPO 可能直接作用于大脑中的血管内皮细胞，促进后者产生更多的血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、脑衍生营养因子(brain derived growth factor，BDGF)加速血管再生和少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells，OPCs)的再生［16］。之后又有研究者发现EPO 可以募集内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)至组织损伤区域，形成微脉管结构，然后在VEGF、Ang-1 的参与下，促进和维持微脉管的完整性［17］。

2.4 脑缺血性损伤中EPO 的保护作用与促进神经再生有关 Shingo T 等在体内研究和体外研究中发现了EPO 可以促进多能神经干细胞向神经元前体细胞分化，并且STAT5、NF-κB、神经母细胞特异性转移因子(achaete scute complex homolog 1，Mash1)参与了该作用机制［18］。还有研究者进行了进一步研究，发现EPO 能够促进SVZ 区神经祖细胞的增殖、迁移到损伤的纹状体区，并且可以促进神经祖细胞向神经细胞、少突胶质细胞分化，抑制向星形胶质细胞的分化［19］。以上结果均表明了脑缺血损伤中EPO 的保护作用与促进神经再生有关。

2.5 脑缺血性损伤中EPO 的保护作用与抗氧化应激有关 氧化应激是脑缺血性损伤的重要机制之一，近年来有研究证明EPO 也可以通过参与抗氧化应激发挥脑保护作用。在永久性局灶脑缺血动物模型中，缺血2 h 后给予EPO 治疗，在缺血24 h 后取出脑组织行免疫组化技术和Western blot 检测细胞核因子红系-2 相关因子(nuclear factor erythroid 2-related factor，Nrf2)、Ⅰ型血红素氧合酶(heme oxygenase-1，HO-1)阳性细胞数量和含量，发现在rhEPO 治疗组、模型组、假手术组中依次降低，并且发现了治疗组脑组织中H2O2浓度明显降低［20］。结合以往研究结果，该研究提示了rhEPO可以促进激活Keap1-Nrf2/ARE 抗氧化应激通路，即rhEPO可以使Keap1(Kelch-like ECH-associated protein1，Keap1)与Nrf2 分离，从而激活Nrf2，后者进入细胞核，与抗氧化反应原件(antioxident response element，ARE)结合，从而介导一系列抗氧化酶基因的表达，包括HO-1，发挥保护作用［20］。

2.6 脑缺血性损伤中EPO 的保护作用与抗炎性作用有关 此外，在脑缺血性损伤中还有研究证明了EPO 的抗炎作用。Villa P 等将大鼠一侧大脑中动脉结扎后立即给予rhEPO 治疗，24 h 后发现梗死区内白细胞和小胶质细胞数量明显减少、星形胶质细胞的活化明显受到抑制，另外通过免疫组化技术发现肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、白细胞介素-6(inferleuKi-6，IL-6)、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)均较对照组降低了50%以上，同样的结果在体外实验中也得到了证实。该学者又进行了进一步的研究，却发现rhEPO 并非直接作用于表达EPOR 的星形胶质细胞、小胶质细胞等炎性作用相关细胞，通过抑制炎性介质的合成和释放发挥抗炎作用，而是通过对神经细胞的保护作用，减少神经元的凋亡，从而减弱了炎性作用，即抗炎作用次于神经保护作用［21］。Raluca Reitmeir 等在短暂局部脑缺血动物模型中还发现了EPO 可以明显减少脑缺血半球中的炎性因子IL-1β、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等表达，从而抑制脑萎缩、加快神经功能的恢复［22］。

2.7 脑缺血性损伤中EPO 的其他保护机制 近些年来研究者们还发现EPO 对脑缺血性损伤的其他保护机制。EPO 能够通过抑制丝裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)的磷酸化，减少细胞质膜上组织Ⅳ型水通道蛋白(aquaporin-4，AQP4)含量，从而减轻糖氧夺获/复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/Reox)后星形胶质细胞的细胞水肿、线粒体肿胀［23］;也可以通过激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，恢复AQP4 的磷酸化水平，下调AQP4 的表达，分别起到对AQP4 的快速调节和缓慢调节作用，从而减轻糖氧夺获/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/Rep)后星形胶质细胞的细胞水肿［24］。以上均是在体外星形胶质细胞中证明了EPO 与AQP4 的关系，也有研究者在体内做了相关研究。Olivier Brissaud 等在新生大鼠脑缺血缺氧后超急性期通过磁共振弥散加权成像和免疫组化技术观察到外源性EPO 可以使脑损伤面积减少40%，同时AQP4 的表达含量上调，该研究者推测可能是AQP4 的上调与清除脑组织中过剩的水至血液中有关［25］。还有研究发现了EPO 在脑缺血性损伤中可改善突触可塑性，作用机制与它可以导致突触可塑性相关基因Egr2、Arc 等上调有关［26］。另外在局部脑缺血损伤急性期后EPO 的治疗可以抑制脑缺血损伤区域的反应性星形胶质细胞化，下调损伤对侧大脑半球抗可塑性蛋白神经黏蛋白(neurocan)、ephrin B1 的表达同时上调促可塑性蛋白sprr1 的表达促进损伤对侧锥体束发出突触至去神经分布的区域，加快神经功能恢复［22］。此外还发现了EPO 在脑缺血性损伤的保护作用与代谢酶类调节有关。EPO 预处理可以使原代神经元中的二磷酸核苷激酶A(nucleoside diphosphate kinase A，NDPKA)上调，神经元内NDPKA 的上调或是外源性应用NDPKA 重组蛋白均可以提高脑缺血性相关损伤的动物模型中神经元的生存能力［27］。在全脑缺血动物模型中外源性EPO 可激活海马腹侧神经元的NOS，从而刺激第2 信使cGMP 介导的信号通路增加突触的可塑性［28］。还有研究发现EPO 能够通过抑制磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH)减少脑缺血再灌注损伤后大鼠缺血半暗带中神经元的凋亡［29］。

3 展 望

EPO 在脑缺血损伤中的保护作用已经被大量研究所证实，它的保护机制也日趋明朗化，但仍需进一步探索。此外EPO 在脑缺血性损伤中保护作用的效率性、安全性以及如何将其以最大效率合理利用到脑缺血性损伤的治疗中同样有待进一步研究。这些工作或许可以为脑缺血性损伤的治疗提供一种新的可能性。

［1］Prass K，Scharff A，Ruscher K，et al.Hypoxia-induced stroke tolerance in the mouse is mediated by erythropoietin［J］.Stroke，2003，34(8):1981-1986.

［2］Leconte C，Tixier E，Freret T，et al.Delayed hypoxic postconditioning protects against cerebral ischemia in the mouse［J］.Stroke，2009，40(10):3349-3355.

［3］Wu X，Zhou C，Du F，et al.Ginkgolide B preconditioning on astrocytes promotes neuronal survival in ischemic injury via up-regulating erythropoietin secretion［J］.Neurochemistry International，2013，62(2):157-164.

［4］Changquan L，Liwei D，Hailiang X，et al.Ethanol extract of Portulaca oleracea L.protects against hypoxia-induced neuro damage through modulating endogenous erythropoietin expression［J］.J Nutr Biochem，2012，23(4):385-391.

［5］Hraloa M，Plananska E，Angerova Y，et al.Effects of a single dose of erythropoietin on motor function and cognition after focal brain ischemia in adult rats［J］.Prague Medical Report，2013，115(1～2):5-15.

［6］Xu X，Dai H，Shi Y.Erythropoietin protects primary cultures of rat cortical neurons from hypoxia-induced toxicity through attenuating both glutamate release and NMDA receptor evoked neurotoxicity pathway［J］.Pharmazie，2009，64(3):210-213.

［7］Prosvirnina MS，Shmonin AA，Melnikova EV，et al.Neuroprotective effects of erythropoietin in focal brain ischemia in rats［J］.Bull Exp Biol Med，2014，156(5):642-644.

［8］Digicaylioglu M，Lipton SA.Erythropoietin-mediated neuroprotection involves cross-talk between Jak2 and NF-kappaB signalling cascades［J］.Nature，2001，412(6847):641-647.

［9］Ruscher K，Freyer D，Karsch M，et al.Erythropoietin is a paracrine mediator of ischemic tolerance in the brain:evidence from an in vitro model［J］.J Neurosci，2002，22(23):10291-10301.

［10］Kretz A，Happold CJ，Marticke JK，et al.Erythropoietin promotes regeneration of adult CNS neurons via Jak2/Stat3 and PI3K/AKT pathway activation［J］.Mol Cell Neurosci，2005，29(4):569-579.

［11］Jiang C，Xu Q，Xu K，et al.Effects of erythropoietin on STAT1 and STAT3 levels following cerebral ischemia-reperfusion in rats［J］.International Journal of Neuroscience，2013，123(10):684-690.

［12］Zhu H，Zou L，Tian J，et al.SMND-309，a novel derivative of salvianolic acid B，protects rat brains ischemia and reperfusion injury by targeting the JAK2/STAT3 pathway［J］.Eur J Pharmacol，2013，714(1):23-31.

［13］Souvenir R，Fathali N，Ostrowski RP，et al.Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 mediates erythropoietin-induced neuroprotection in hypoxia ischemia［J］.Neurobiol Dis，2011，44(1):28-37.

［14］Ratilal BO，Arroja MM，Rocha JP，et al.Neuroprotective effects of erythropoietin pretreatment in a rodent model of transient middle cerebral artery occlusion［J］.J Neurosurg，2014，121(1):55-62.

［15］Liu K，Sun T，Wang P，et al.Effects of Erythropoietin on blood-brain barrier tight junctions in ischemia-reperfusion rats［J］.J Mol Neuros-ci，2013，49(2):369-379.

［16］Kim YJ，Jung YW.Systemic injection of recombinant human erythropoietin after focal cerebral ischemia enhances oligodendroglial and endothelial progenitor cells in rat brain［J］.Anat Cell Biol，2010，43(2):140-149.

［17］Zhu L，Bai X，Wang S，et al.Recombinant human erythropoietin augments angiogenic responses in a neonatal rat model of cerebral unilateral hypoxia-ischemia［J］.Neonatology，2014，106(2):143-148.

［18］Shingo T，Sorokan ST，Shimazaki T，et al.Erythropoietin regulates the in vitro and in vivo production of neuronal progenitors by mammalian forebrain neural stem cells［J］.J Neurosci，2001，21(24):9733-9743.

［19］Gonzalez FF，Larpthaveesarp A，McQuillen P，et al.Erythropoietin increases neurogenesis and oligodendrogliosis of subventricular zone precursor cells after neonatal stroke［J］.Stroke，2013，44(3):753-758.

［20］Meng H，Guo J，Wang H，et al.Erythropoietin activates Keap1-Nrf2/ARE pathway in rat brain after ischemia［J］.Int J Neurosci，2014，124(5):362-368.

［21］Villa P，Bigini P，Mennini T，et al.Erythropoietin selectively attenuates cytokine production and inflammation in cerebral ischemia by targeting neuronal apoptosis［J］.J Exp Med，2003，198(6):971-975.

［22］Reitmeir R，Kilic E，Kilic A，et al.Post-acute delivery of erythropoietin induces stroke recovery by promoting perilesional tissue remodelling and contralesional pyramidal tract plasticity［J］.Brain，2011，134(1):84-99.

［23］Tang Z，Sun X，Huo G，et al.Protective effects of erythropoietin on astrocytic swelling after oxygen-glucose deprivation and reoxygenation:Mediation through AQP4 expression and MAPK pathway［J］.Neuropharmacology，2013，67:8-15.

［24］Tang Z，Sun X，Shi Q，et al.Beneficial effects of carbamylated erythropoietin against oxygen-glucose deprivation/reperfusion-induced astrocyte swelling:Proposed molecular mechanisms of action［J］.Neurosci Lett，2012，530(1):23-28.

［25］Brissaud O，Villega F，Konsman JP，et al.Short-term effect of erythropoietin on brain lesions and aquaporin-4 expression in a hypoxicischemic neonatal rat model assessed by magnetic resonance diffusion weighted imaging and immunohistochemistry［J］.Pediatr Res，2010，68(2):123-127.

［26］Mengozzi M，Cervellini I，Villa P，et al.Erythropoietin-induced changes in brain gene expression reveal induction of synaptic plasticity genes in experimental stroke［J］.Proc Natl Acad Sci，2012，109(24):9617-9622.

［27］Teoh J，Boulos S，Chieng J，et al.Erythropoietin increases neuronal NDPKA expression，and NDPKA Up-regulation as well as exogenous application protects cortical neurons from in vitro ischemia-related insults［J］.Cell Mol Neurobiol，2014，34(3):379-392.

［28］Samson ML，Kajitani K，Robertson GS.Nitric-oxide synthase mediates the ability of darbepoetin alfa to attenuate pre-existing spatial working memory deficits in rats subjected to transient global ischemia［J］.J Pharmacol Exp Ther，2010，333(2):437-444.

［29］Guan YZ，Guo R，Nian H，et al.Involvement of inhibition of nucleus GAPDH over-expression in erythropoietin’s reduction of neuronal apoptosis induced by brain ischemia/reperfusion in rats［J］.Sheng Li Xue Bao，2012，64(3):269-274.