羟基红花黄色素A对心肌细胞缺血/再灌注损伤的保护作用

许爱斌，刘建国，张健，李俊峡，和渝斌

• 论著 •

羟基红花黄色素A对心肌细胞缺血/再灌注损伤的保护作用

许爱斌，刘建国，张健，李俊峡，和渝斌

目的研究羟基红花黄色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）对心肌细胞模拟缺血/再灌注（simulated ischemia/reperfusion，SI/R）损伤的保护作用。方法采用H9c2心肌细胞建立SI/R损伤模型，检测心肌细胞存活率、乳酸脱氢酶（LDH）水平，TUNEL染色法检测细胞凋亡，Western blot检测Akt/ eNOS信号通路蛋白的表达。结果与SI/R组比较，20μM HSYA预处理能显著提高SI/R损伤的H9c2细胞的存活率，（69.7±5.8）% vs. （79.9±5.8）%，差异有统计学意义（P＜0.05）。与Control 组相比，SI/R组心肌细胞LDH释放增加，（43.3±9.4）U/L vs. （129.5±11.9）U/L，差异有统计学意义（P＜0.05）。与SI/R组相比，HSYA可显著降低LDH的释放，而加入PI3K的抑制剂LY29004后，这种作用消失。与Control组比较，SI/R损伤显著增加H9c2心肌细胞的凋亡率，差异有统计学意义（P＜0.05）；与SI/R组相比，SI/ R+HSYA组细胞凋亡率显著下降，而加入LY29004后，逆转了HSYA的抑制凋亡的作用。与SI/R组相比，SI/R+HSYA组 p-Akt蛋白的表达显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），加入LY29004后 p-Akt 蛋白的表达被明显抑制。与SI/R组比较，SI/R+HSYA组 p-eNOS 蛋白的表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），加入LY29004后 p-eNOS蛋白的表达被明显抑制。结论羟基红花黄色素A能增强H9c2细胞活力，减少心肌细胞损伤，抑制心肌细胞凋亡，并通过激活Akt/eNOS信号通路发挥保护作用。

羟基红花黄色素A；缺血/再灌注损伤；心肌细胞；凋亡

心血管疾病是危害人类生命健康的主要疾病之一，目前是工业国家患者死亡的主要原因[1]。虽然临床上可以采取支架置入或者冠脉搭桥等方法来复通堵塞的血管，恢复血流支配，但缺血区的损伤反而加重，这种继发的心肌缺血/再灌注（myocardial ischemia/reperfusion，M/IR）损伤已经成为冠心病治疗研究的一个热点[2]。近年来，研究发现中药中活血化瘀药可促进缺血组织血管新生，能减轻M/IR损伤，显示出其在M/IR损伤防治中的潜在应用价值[3,4]。中药红花功能主治是活血化瘀，其中红花黄素是其提取物，羟基红花黄色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）是其主要药效成分[5]。本研究利用H9c2心肌细胞模拟缺血/再灌注（simulated ischemia/reperfusion，SI/R）损伤，旨在探讨HSYA对M/IR损伤的保护作用及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料H9c2细胞株购于American Type Culture Collection（ATCC，VA，USA）。H S Y A购自中国药品生物制品检定所（批号：111637-200905）。DMEM-HG培养基（Gibco），胎牛血清（Gibco），p-Akt、Akt、p-eNOS、eNOS一抗（CST），二抗（sigma），TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（碧云天生物技术研究所），乳酸脱氢酶检测试剂盒LDH（南京建成生物工程研究所），MTT（sigma），LY29004（sigma）。

1.2 主要仪器超净工作台（江苏苏净，SW-CJ-1FB），细胞培养箱（Thermo），恒温摇床（上海福玛，KYS-100C），台式离心机（长沙湘仪，TDZ5-WS），多功能酶标仪（TECAN），倒置显微镜（Olympus）。

1.3 SI/R损伤模型建立模型建立参考文献[6]：H9c2细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于含5%CO2的37℃培养箱中孵育。待细胞长到80%～90%融合时改用无血清的DMEM培养，放置于95%N2/5%CO2的环境中孵育10h后，更换为含10%胎牛血清的DMED培养基继续37℃常规培养2h。

1.4 分组除MTT实验外，将培养的H9c2心肌细胞分为5组。①Control组：加入含10%胎牛血清的DMED培养基，置于5%CO2的37℃培养箱中常规培养；②SI/R组：按照1.3项中的造模方法建立SI/R损伤模型；③SI/R+HSYA组：培养基中加入20μM HSYA，24h后建立SI/R损伤模型，其余操作同上；④SI/R+LY29004组：培养基中加入10μM LY29004（PI3K抑制剂），1h后建立SI/R损伤模型，其余同上；⑤SI/R+ HSYA +LY29004组：在SI/R过程前的24h和1h，分别加入20μM HSYA和10μM LY29004，其余操作同上。

1.5 检测指标

1.5.1 MTT检测细胞以1×104个/孔的密度接种于96孔板，培养24h后，按上述方法建立SI/R损伤模型后，加入20μl的浓度为5 mg/ml的MTT，37℃孵育4h，小心去除上清液，每孔加入500μl的DMSO，充分溶解结晶，酶标仪490 nm处测OD值。细胞存活率（%）= 处理组OD值/对照组OD值×100%。

1.5.2 细胞损伤检测分别收集各组培养的心肌细胞上清，2000 r/min离心20min后取上清，参照试剂盒说明书检测LDH活力。

1.5.3 TUNEL染色根据TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，PBS洗后固定，加入0.1%Triton X-100，冰浴孵育2min，加入TUNEL检测液，37℃孵育60min，封片后荧光显微镜下观察绿色荧光。

1.5.4 western blot检测H9c2细胞按前述分组处理后去除培养上清，PBS洗涤1次，加入蛋白裂解液，冰浴孵育20min，收集裂解液，4℃下12000g离心20min，吸取上清液，测定蛋白浓度。各取30 μg蛋白样品，12% SDS-PAGE电泳后转膜，封闭后，加一抗4℃孵育过夜，洗膜后，二抗室温孵育1h，再洗膜后，曝光显影，Biorad GelDoc XR+凝胶成像分析系统摄像，分析目的条带的灰度值。

1.6 统计学方法采用SPSS 16.0统计软件分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，两组间均数的比较采用t检验，多组间比较采用方差分析；计数资料采用例数（构成比）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌细胞存活率MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法。与SI/R组比较，20μM HSYA预处理能显著提高SI/R损伤的H9c2细胞的存活率，（69.7±5.8）% vs. （79.9±5.8）%，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1）。

2.2 LDH活性比较正常情况下，LDH存在于细胞胞浆中，当心肌细胞损伤时，LDH被释放到培养上清液中。与Control 组相比，SI/R组LDH释放增加，（43.3±9.4）U/L vs. （129.5±11.9）U/L，差异有统计学意义（P＜0.05）。与SI/R组相比，HSYA可显著降低LDH的释放，而加入PI3K的抑制剂LY29004后，这种作用消失，表明HSYA具有保护心肌细胞不受损伤的作用，而这种保护可能是通过PI3K这条途径发挥作用的（图2）。

2.3 TUNEL染色TUNEL法通过绿色荧光探针标记，特异性检测细胞凋亡时产生的断裂的DNA片段。与Control组比较，SI/R损伤显著增加H9c2心肌细胞的凋亡率，差异有统计学意义（P＜0.05）；与SI/R组相比，SI/R+HSYA组细胞凋亡率显著下降，而加入LY29004后，逆转了HSYA的抑制凋亡的作用，表明HSYA能够抑制SI/R诱

导的H9c2心肌细胞凋亡，并且是通过激活PI3K通路发挥作用（图3）。

2.4 western blot检测结果为进一步明确PI3K通路在HSYA保护心肌细胞中的作用，继续检测了PI3K的下游关键蛋白Akt-eNOS的表达。western blot检测结果表明，与Control组比较，SI/R组p-Akt蛋白表达略有增加，但无统计学意义（P＞0.05）；与SI/R组相比，SI/R+HSYA组p-Akt蛋白的表达显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），加入LY29004后p-Akt蛋白的表达被明显抑制。与SI/R组比较，SI/R+HSYA组p-eNOS蛋白的表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），加入LY29004后 p-eNOS蛋白的表达被明显抑制（图4）。

3 讨论

心肌缺血缺氧是冠心病的主要发病机制，而M/IR损伤是指在心肌缺血后恢复血流反而加重心肌细胞和组织的损伤[7]，目前中药在抗M/IR损伤和心肌保护方面具有潜在科研和临床价值[8]。中药丹红注射液虽已广泛应用于临床，但是其具体作用机制尚不清楚。

本研究通过细胞培养模拟M/IR损伤研究红花有效成分HSYA的作用机制。从细胞和分子水平来研究药物对心血管疾病的保护作用及机制，也是目前心血管疾病研究的常规方法[9]。研究结果表明HSYA 能够提高SI/R损伤模型的心肌细胞活力，减少细胞死亡，提示具有心肌保护作用。HSYA可显著降低LDH的释放，减少细胞的凋亡，而加入PI3K的抑制剂LY29004后这种保护和抗凋亡作用消失。同时，western blot检测表明HSYA能够使SI/R损伤的心肌细胞中Akt和eNOS磷酸化表达增加，加入抑制剂后该作用消失，证实HSYA的保护作用是通过激活PI3K-Akt-eNOS这条通路发挥的。而PI3K-Akt-eNOS是缺血/再灌注损伤补救酶（RISK）信号转导通路的组成之一，是细胞内重要信号转导通路之一[10,11]。

目前中药对心血管疾病的治疗及心血管保护作用机制是中医药学研究的热点，也是中药长期发展的一个重要研究领域。本研究发现，HSYA可明显提高心肌细胞的存活率，减少SI/R损伤后的LDH释放，同时采用RISK通路的抑制剂证实了HSYA对心肌的保护作用可能主要是通过PI3KAkt-eNOS通路发挥的作用，进一步阐明了其心肌保护作用机制。

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Preventive effect of hydroxysafflor yellow A (HSYA) on cardiomyocyte ischemia-reperfusion injury

XU Ai-bin*, LIU Jian-guo, ZHANG Jian, LI Jun-Xia, HE Yu-bin.*Department of Cardiovascular Diseases, General Hospital of Chinese PLA Beijing Military Area Command, Beijing 100700, China.

ObjectiveTo study the preventive effect of hydroxysafflor yellow A (HSYA) on simulated cardiomyocyte ischemia-reperfusion (SI/R) injury.MethodsThe model of SI/R injury was established by using H9c2 cardiomyocyte. The survival rate of cardiomyocyte and level of lactate dehydrogenase (LDH) were detected, apoptosis was detected by using TUNEL staining assay, and Akt/eNOS protein expressions were detected by using Western blot test.ResutlsThe survival rate of H9c2 cardiomyocyte with SI/R injury increased significantly in SI/R+HSYA group compared with SI/R group [(69.7±5.8) % vs. (79.9±5.8)%, P＜0.05]. The release of LDH increased in SI/R group compared with control group [(43.3±9.4) U/L vs. (129.5±11.9) U/L, P＜0.05]. HSYA decreased significantly the release of LDH, which disappeared after LY29004 (PI3K inhibitor) added. The apoptosis rate of H9c2 cardiomyocyte increased significantly in SI/R group compared with control group (P＜0.05). The apoptosis rate of H9c2 cardiomyocyte decreased significantly in SI/R+HSYA group compared with SI/R group, which was reversed after LY29004 added. The expression of p-Akt increased significantly in SI/R+HSYA group compared with SI/R group (P＜0.05), which was significantly inhibited after LY29004 added. The expression of p-eNOS increased significantly in SI/R+HSYA group compared with SI/R group (P＜0.05), which was significantly inhibited after LY29004 added.ConclusionHSYA can improve the viability of H9c2 cardiomyocyte, relieve cardiomyocyte injury, inhibit cardiomyocyte apoptosis, and play a protective role through activating Akt/eNOS signal path.

Hydroxysafflor yellow A; Ischemia-reperfusion injury; Cardiomyocyte; Apoptosis

R541.4

A

1674-4055(2015)05-0663-03

2015-04-12）

（责任编辑：姚雪莉）

100700 北京,北京军区总医院心血管内科

许爱斌,E-mail:947931686@qq.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2015.05.24