外源酶制剂评定的方法探讨

■艾 琴 左建军 赵江涛 冯定远

（1.广东大华农动物保健品股份有限公司，广东云浮 527439；2.华南农业大学动物科学学院，广东广州 510642；3.广东温氏食品集团股份有限公司，广东云浮 527439）

我国饲用酶的研究始于20世纪70年代，80年代后期到90年代，饲用复合酶的研究、开发、应用在我国同步进行并被列入“八五”国家科技攻关项目，从此，饲用酶开始在我国广泛推广应用。但是多年过去了，除植酸酶外，其他的外源非淀粉多糖（NSP）酶和消化酶的应用仍然处于探索阶段。究其原因，虽然目前外源酶制剂的评定方法较多，但缺乏统一性、标准化和有效性，众多评价方法对生产应用的指导性不强。本文结合家禽消化道条件，着重总结了体内养分消化率和体外模拟法两类评定方法在外源酶制剂评定中的应用，旨在为后期的外源酶评定提供理论基础。

体内养分消化率测定法又称生物学评定法，目前应用较多的有肛门全收粪法、排空-强饲法和回肠末端消化产物法（见表1）。体外模拟法是体内外模拟动物消化道的黑箱环境进行的一系列消化吸收试验，笔者根据近年来体外模拟中选用消化酶来源的不同，将其划分为外源酶评定、内源酶评定和仿生酶评定三种。以下分别进行论述。

表1 常用外源酶制剂体内和体外养分消化率评定方法

1 外源酶制剂体内养分消化率评定法

1.1 评定方法简介

全收粪法（Total Excreta）是经典的传统消化实验方法，是一切消化实验的基础，但是对实验动物和试验场地的准备和要求较高，例如，首先需要选择健康有代表性的动物，且要达到一定的规模，若实验动物过少，测值代表性差，若过多，测值准确性虽略有提高，但费用和工作量都增加，且难以精确统计饲料的摄入量。其次，需要无损地收集所有受试动物的全部粪便，并需精细剔除粪便中可能存在的羽毛、皮屑、饲料等杂质，否则严重影响测值的准确性。工作强度非常之大，因此，在传统营养学研究中该方法逐渐被排空-强饲法取代。

排空-强饲法（Emptying-force-feeding）又称真代谢能法，基本操作过程包括36 h的饥饿期和48 h的排泄物收集期，强饲量为25 g，同期测定内源养分损失以矫正养分利用率。该方法既可准确地测定饲料的摄入量，也大大降低了残留在消化道内的食糜对排泄物的影响，是目前饲料原料价值评定的主要方法，但其在外源酶制剂评定中的适用性尚需验证。

回肠末端消化法（Ileal digesta）的基本操作过程为，家禽颈部脱臼或家畜宰杀后，迅速剖开腹部，结扎卵黄囊憩室和回盲肠结合部肠段，采集该段消化道内容物测定养分消化率。该法虽然可获得整个消化道的系统信息，但耗费试验动物较多，采样时间难以一致，且样本缺乏延续性。为了解决以上问题，研究人员相继成功建立了单胃动物回肠瘘管模型。该模型的建立为研究单胃动物回肠末端消化的时间和空间变化以及采样时间的确定提供基础理论依据。但是相对于体型较小、抗应激性较差的家禽，其手术操作风险较大。

1.2 三种体内养分消化率评定法的比较

全收粪法（Total Excreta）、排空-强饲法（Empty⁃ing-force-feeding）和回肠末端消化法（Ileal digesta）比较研究发现，排空-强饲法多用于饲料原料营养价值评定，该方法较好地规避了原料间的互作效应，可较为精确地控制采食量和排泄量，但对受试鸡的应激性较大，且持续时间短，对酶制剂评定的适用性有待验证。与肛门全收粪法相比，回肠末端收粪法排除了后肠微生物对养分消化率的影响，理论上可更真实地反映酶制剂作用效果，但受肠道排空速度的影响，各段肠道食糜量变异较大，样品容易缺乏代表性。对于三种生物学法在酶制剂应用中的比较研究较少，目前仅见一篇文献报道：在测定酶制剂对蛋白消化率的影响时发现三种生物学法具有相同的变化趋势。

2 外源酶制剂体外模拟消化法

数年来科学家们一直在探索畜禽消化道环境，并试图建立高模拟度的仿生消化系统。总结各种文献资料，体外消化法按照模拟所使用的消化酶酶谱及来源不同可分为三类：外源酶法、内源酶法和仿生酶法。

2.1 外源酶法

外源酶法的代表为Boisen等（1995）建立的以胃蛋白酶和猪胰液素模拟动物胃和肠期消化酶为主的消化程序。根据不同的模拟阶段又分为一步法和两步法。一步法主要模拟胃部的消化过程，即胃酶水解法。该法主要用来评定饲料中蛋白质的营养价值。所用胃酶主要有胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和链霉蛋白酶。但目前应用最多的还是胃蛋白酶，因为动物体内胃部的主要消化酶是胃蛋白酶，胃部其它酶含量很低，因此，采用胃蛋白酶进行体外模拟更接近动物的实际生产情况，使体外法所测得的结果具有代表性。但这个方法测定结果易受pH值和胃蛋白酶剂量的影响。笔者实验室研究发现，当pH值越低，胃蛋白酶活性越高，所测得蛋白质消化率高。保持pH值不变，胃蛋白酶剂量越大，所测得蛋白体外消化率越高，但这样评价的饲料蛋白体外消化率基本没有差别，因为当胃蛋白酶剂量足够高时，低质的蛋白质饲料也将被全部降解。而且胃部酶解法只模拟了胃部的消化过程，没有考虑后肠段的消化，蛋白质饲料除了受胃蛋白酶降解外，还受到小肠中胰蛋白酶、糜蛋白酶的降解和大肠中一些微生物的降解。因此，胃部酶解法只能作为初步的蛋白质饲料评价方法。两步法主要模拟胃部和小肠部的消化过程，采用胃蛋白酶-胰蛋白酶法或胃蛋白酶-胰液素法。据报道，胃蛋白酶-胰蛋白酶法可以准确地评价蛋白质饲料的体外消化率，并与体内消化率有极强的相关性，但对矿物质及配合饲料的评价准确率较差。因为小肠的消化酶除了胰蛋白酶外，还含有淀粉酶、脂肪酶、糜蛋白酶等等。因此只有充分考虑各种酶的综合效应才能得到准确的体外评价效果。胃蛋白酶-胰液素法是目前应用最多的两步法，胰液素中包含了小肠中主要的消化酶类，并且胰液素已经商品化，稳定性较好，但胰液素没有考虑以不同动物之间酶谱的差异性，因此精确性较差。

2.2 内源酶法

内源酶法指在胃蛋白酶水解的基础上，辅以模拟小肠的pH值、温度及消化酶浓度。小肠液是直接从动物体内获取的消化液，这更接近动物的消化实际，但所用消化液含有的消化成分变动幅度较大，稳定性差，用此方法测出的结果可比性差。此外，虽然Saka⁃moto等(1980)、卢福庄等(1985)和杜荣等(1995)均证明利用猪的消化酶谱来模拟鸡体内消化过程是可行的，但亦有研究指出鸡十二指肠及后肠液中胰蛋白酶和糜蛋白酶活性远高于猪小肠液中的，且猪胰液素中酶的活性及组成、酶水解条件是制约该方法准确评定鸡日粮体外消化能的主要限制因素，因此，该方法已逐渐退出了体外评定体系。

2.3 仿生消化酶法

仿生消化酶法指通过体内试验测定畜禽各段消化道的pH值、温度及消化酶酶谱和浓度，然后利用定标的商品单酶制剂配制。围绕家禽消化液中酶谱的组成，我国科研人员研发了适用于禽类的“空肠T型瘘管”，并在此基础上相继探索了北京鸭和黄羽肉鸡消化液中酶谱组成及小肠食糜流量变化规律，研制了一套适用于黄羽肉鸡的仿生消化液试剂盒，并在前期获取的家禽胃肠道消化生理参数及手工模拟消化操作过程基础上，开发了“单胃动物仿生消化系统”。

比较外源酶法和仿生酶法胃期和肠期主要参数可见（见表2），仿生消化法缩短了胃期和肠期消化时间，并将肠期分为小肠前段和后段，分别采用不同的缓冲液，且在肠期使用家禽模拟小肠液。可见，仿生消化法操作程序对家禽消化生理的模拟程度更高，且实现了半自动化操作，有效降低了系统误差。但是无论外源酶法还是仿生消化法，其开发目的均为饲料原料营养价值评定，因此，在胃期和肠期胃蛋白酶和胰液素或人工小肠液的添加浓度均为过量。而待测日粮（配合饲料）的添加量仅为2 g，若按照大生产中外源酶的添加量500 g/t计算，2 g配合日粮中外源酶的添加量（质量）仅为1 mg，如此微量的蛋白类物质在过量模拟胃液和小肠液的作用下，酶活力存留率为多少尚未见详尽报道，因此，确定体外消化过程中酶制剂的适宜添加量是建立酶制剂体外消化评估方法可行性的参数之一。

表2 Boisen(1991)法与仿生消化法胃期和肠期主要参数比较

此外，体外消化法测定值较好地回归校正到体内养分消化率测定值是检测体外模拟消化可行性的重要标准。但相关研究报道较少，仅见Bedford（1993）、张铁鹰（2002）和王宁娟（2009）分别对添加酶制剂后食糜黏度、日粮磷利用率及干物质、粗蛋白、能量、钙、磷消化率进行了体内外评价相关性检验，证明各自建立的体外评价体系可较好地反映酶制剂体内的生物学效价，其重复性有待验证。

3 家禽消化道内环境对酶制剂体外评定的影响

长久以来，酶制剂体外评定程序较好地借用了饲料原料营养价值评定程序，随着饲料原料营养价值评定程序的不断规范化、标准化、精确化，酶制剂的体外评定程序也将日趋完善。但在此过程中，我们必须区分其目的性，酶制剂的评定其主要评定对象是酶制剂，其活力的体现受家禽消化道内环境的影响。In⁃borr等(1993)利用体外消化模拟法对木聚糖酶和一种饲用复合酶在单胃动物前段消化道内的稳定性进行了研究，结果表明，低pH值、胃蛋白酶和胰酶均能够使饲用酶活性降低，饲用酶活稳定性受三者的影响具有相似变化趋势。Almirall等(1995)体内外条件下，低、中、高pH值和添加胃蛋白酶或胰酶对β-葡聚糖酶活力影响的研究中也得出同样结论。为了提高体外模拟程度，使酶制剂的评价更加客观性，本文总结了鸡各消化道的pH值范围(见表3)，结果显示，嗉囊、腺胃、肌胃、十二指肠、空肠、回肠和盲肠分别为：4.56～6.29、3.09～5.20、2.69～4.02、4.78～6.57、5.63～8.12、5.87～8.79、4.96～6.20，其中胃期pH值均高于传统模型中选用的pH值2.0。此外，调查发现，仿生消化模型中使用的胃蛋白酶能够使饲用酶活力降低。本课题组前期研究中发现，在pH值一定时，不同菌种来源的木聚糖酶对胃蛋白酶或胃蛋白酶-胰蛋白酶表现出不同的耐受性，且有研究指出，胃蛋白酶对木聚糖酶活力的影响更大，因此，适宜胃蛋白酶水平是确保体外消化评定饲料营养价值和饲用酶作用效果可靠性的另一关键因素。但目前使用的体外消化法中，胃蛋白酶浓度和胃期消化时间却无统一标准。由表4可见，当以猪为试验动物时，胃蛋白酶浓度从0.56～220 U/(ml反应体积)不等，而鸡的胃蛋白酶浓度则有用到2 000 U/(ml反应体积)；消化时间则从0.75～6 h不等。张铁鹰（2002）研究认为，腺胃和肌胃食糜中胃蛋白酶水平与日龄呈3次曲线关系（y=1E-06x3-0.000 4x2+0.034x+0.096，R2=0.708 5；其中，y为胃蛋白酶水平，x为日龄），根据该回归方程可以计算出任意日龄肉仔鸡消化道食糜中胃蛋白酶的酶活水平。然而，胃、肠道蛋白酶酶活水平受日粮类型和昼夜规律的影响无法精确定量。虽然胃蛋白酶对木聚糖酶作用方式及机制的研究目前尚不清楚，但随着微胶囊包被、控释技术的不断发展与完善，外源酶制剂耐酸和耐胃蛋白酶的性质将随使用目的的不同而呈现产品多样化。

4 结语

许多学者认为外源酶制剂效果的评价除了考虑该酶的酶学性质外，还应同时考虑家畜的内环境。上文综述显示，目前的体外模拟评定体系建立与参数选用较多沿用了单胃动物饲料原料能量的体外评定方法，并未完全考虑动物的消化道环境和外源酶制剂的适用性。因此，所测数据可能无法代表外源酶的实际作用效果。此外，体外模拟法测定值必须回归校正生物学法才具有生物学意义，而全收粪法、回肠末端收粪法和排空-强饲法三种体内消化率测定值虽在酶制剂评定中均有应用，但由于各种方法对所测指标的适用性不同导致消化试验结果差异较大，所测数据及所建立的回归方程不具有代表性和适用性。因此，为了使外源酶制剂的评定方法更加规范化，评定数据具有可比性、适用性和实际价值，适宜体内消化率测定方法的选择和体外模拟参数及方法的确定显得尤为重要。

表3 鸡各段消化道pH值

表4 体外模拟法胃期反应体系中胃蛋白酶浓度

（参考文献42篇，刊略，需者可函索）