葡萄糖氧化酶体外抑菌和产酸效果试验研究

■汤海鸥 高秀华 姚 斌 张广民 王振兴 孔祥书

（1.中国农业科学院饲料研究所农业部饲料生物技术重点实验室，北京 100081；2.生物饲料开发国家工程研究中心，北京 100081；3.河南省黄泛区鑫欣牧业有限公司，河南黄泛区 466632）

外界环境的变化及摄入食物可能影响动物肠道中微生物菌群的平衡，造成有害菌群生长和腹泻等消化道疾病，引起畜禽类动物消化道疾病常见的病源微生物主要有大肠杆菌和沙门氏菌等。传统预防胃肠道疾病多以在饲料中添加抗生素类药物，抗菌药在动物上的长期大量使用，易引起机体胃肠功能紊乱，使耐药菌株增加。因此，世界各国都开展着对抗生素替代物的研究。葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOD）是一种能够催化葡萄糖被分子氧或原子氧氧化为葡萄糖酸内酯和过氧化氢的氧化还原酶，其中葡萄糖酸内酯可以自发水解成为葡萄糖酸，具有类似酸化剂的作用，过氧化氢具有广谱杀菌作用，可以起到抑制大肠杆菌、沙门氏菌等致病微生物生长繁殖的作用[1-2]，1999年GOD就已被列入农业部饲料添加剂品种目录中规定可以添加使用的饲用酶制剂之一，本实验室通过基因克隆技术在毕赤酵母生物反应器中进行高效表达，采用液体深层发酵方式使GOD酶活水平达到了615 U/ml，大大降低了生产成本[3]。前期试验研究表明，GOD能有效地改善单胃动物胃肠道健康，提高畜禽的生长性能[4-5]。然而，GOD在动物生产上发挥效果的具体抑菌、产酸功能，并未见有具体的体外验证试验文献报道。鉴于此，本试验通过单层平板扩散试验和pH值测定试验研究GOD对大肠杆菌、沙门氏菌的体外抑菌效果和产酸能力，探讨GOD在动物生产上发挥效果的作用机理，为GOD在畜牧业上的广泛应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验酶菌

试验用饲用葡萄糖氧化酶产品由农业部饲料生物技术重点实验室提供，酶活含量大于1 000 U/g（酶活定义为：在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟内从过量底物中降解释放1 μmol产物所需的酶量定义为1个酶活力单位，即1 U）；致病性大肠杆菌、沙门氏菌购自于中国兽医药品监察所。

1.1.2 试验仪器

BCL-1360A型洁净工作台，北京亚泰科隆仪器技术有限公司；LDZX-50型高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；DNP-9052型电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；DGP-9057B-2型培养箱/干燥箱，上海福玛实验设备有限公司；HZQ-X100型振荡培养箱，太仓市实验设备厂；150 mm型游标卡尺，上海力成五金工具有限公司；FE20型实验pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2 溶液、培养基及配制方法

1.2.1 营养琼脂配制

蛋白胨 1.0 g、酵母粉 0.5 g、NaCl 0.9 g、琼脂粉1.5 g，加蒸馏水100 ml，混匀并充分溶解，121℃高压蒸汽灭菌20 min，冷却到55℃左右倾注平皿，待培养基凝固后倒置，置37℃培养箱过夜进行无菌检验，合格后置4℃冰箱保存备用。营养肉汤成分相同，只是不加琼脂粉，分装到试管后再进行灭菌。

1.2.2 底物葡萄糖溶液（GS）

根据需要，取不同量葡萄糖，溶于去离子水，定容至100 ml，摇匀后即可使用。

1.2.3 乙酸-乙酸钠缓冲溶液（0.1 mol/l，pH值5.5）

称取三水乙酸钠11.57 g，加入冰乙酸0.85 ml。再加水溶解，定容至1 000 ml，测定溶液的pH值。如果pH值偏离5.5，再用乙酸溶液或乙酸钠溶液（0.1 mol/l乙酸溶液：吸取冰乙酸0.60 ml，加水溶解，定容至100 ml；0.1 mol/l乙酸钠溶液：称取三水乙酸钠1.36 g。加水溶解，定容至100 ml）调节至5.5。

1.2.4 生理盐水

取NaCl 9.0 g，加蒸馏水1 000 ml，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min后冷却待用。

1.3 抑菌、产酸试验操作方法

1.3.1 不同浓度葡萄糖溶液和GOD溶液抑菌试验方法

用灭菌水配制成含有葡萄糖0、0.062 5、0.125、0.25 g/ml的溶液，用灭菌乙酸盐缓冲液（pH值5.5）配制成含GOD 0、12.5、25、50 U/ml的溶液，分别采用牛津杯抑菌试验方法，在牛津杯中加入试验溶液270 μl，置于37℃恒温培养箱培养18～24 h，以抑菌圈清晰为好，测定抑菌圈直径，以毫米（mm）为单位。每个样品做3平行板。以下同。

1.3.2 牛津杯大肠杆菌抑菌试验操作方法

将培养好的大肠杆菌用无菌生理盐水稀释成浓度约为107CFU/ml的菌液，吸取100 μl涂布于制备好的营养琼脂平板上，然后再等距离地放置灭菌好的牛津杯，静置5 min。取配置好的50 U/ml GOD 1.0 ml与0.1 g/ml（10%）GS 1.0 ml等体积混合，混合液再用灭菌乙酸缓冲液（pH值5.5）稀释成含GOD 25、12.5、6.25、3.125 U/ml的溶液，37 ℃反应10 min后，取混合溶液270 μl加入牛津杯。

1.3.3 不同温度处理下GOD抑制大肠杆菌试验方法

分别取10.0 g GOD样品置于不同温度干热处理10 min，然后将处理过的GOD取适量全部配制成GOD浓度为50 U/ml的溶液，将50 U/ml的GOD 1.0 ml与0.09 g/ml（0.5 mol/l）GS 1.0 ml等体积混合，混合液含GOD 25 U/ml，37 ℃反应10 min后，采用“1.3.2”牛津杯抑菌试验方法，取混合溶液270 μl加入牛津杯。

1.3.4 牛津杯沙门氏菌抑菌试验操作方法

将培养好的沙门氏菌用无菌生理盐水稀释成浓度约为107CFU/ml的菌液，吸取100 μl涂布于制备好的营养琼脂平板上，然后再等距离地放置上灭菌的牛津杯，静置5 min。取粉末型GOD 1.0 g溶解于100 ml灭菌乙酸盐缓冲液中，GOD浓度为10 U/ml，然后用灭菌乙酸缓冲液分别稀释成含GOD 5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 U/ml的溶液，6种浓度的酶液分别取1.0 ml酶液与0.1 g/ml（10%）GS 1.0 ml等体积混合，混合液GOD浓度则相应稀释为5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 U/ml，37 ℃反应10 min后，取混合溶液270 μl加入牛津杯，置于37℃恒温培养箱培养18～24 h，以抑菌圈清晰为好，测定抑菌圈直径。每个样品做3平行板。

1.3.5 GOD体外产酸试验操作方法

用FE20型实验pH计测定初始配制好的葡萄糖溶液pH值，记为起始值。加入适量GOD样品后，置于恒温振荡箱39℃、150 r/min振荡。0.2 g GOD加入100 ml 20%（0.2 g/ml）GS溶液中，溶液中GOD酶活为1.0 U/ml。每隔1 h测量溶液pH值。每个样品做3平行。

1.4 数据统计与分析

采用SPSS 17.0统计软件，应用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行差异显著性分析，采用LSD法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果

2.1 GOD对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌结果

试验结果表明，分别加入不同浓度葡萄糖或GOD溶液的结果表明所有试验样品都未见抑菌圈。

不同浓度和温度处理下，GOD混合液抑制大肠杆菌和沙门氏菌试验结果如表2、3、4。随着GOD浓度的逐倍降低，对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌圈直径相应也逐渐变小，且有些浓度之间出现显著性差异（P＜0.05）。在65℃温度处理下的GOD对大肠杆菌抑菌圈与常温对照组未出现显著性差异（P＞0.05），但在高于65℃条件下抑菌圈结果随着温度升高出现逐步降低的趋势，高温影响了GOD的抑菌效果，且65℃与75℃之间有显著性差异（P＜0.05）。

表2 不同浓度GOD混合液对大肠杆菌抑菌试验结果

表3 不同温度处理GOD对大肠杆菌抑菌试验结果

表4 不同浓度GOD混合液对沙门氏菌抑菌试验结果

2.2 GOD体外产酸对pH值的影响（见表5）

表5 GOD混合液随时间pH值变化结果

由表5可知，随着时间的变长，GOD产酸效果越明显，pH值从最初的5.61降低到3.03，呈逐渐降低趋势，且部分结果之间有显著性差异（P＜0.05）。

3 讨论

大肠杆菌和沙门氏菌都是动物肠道中常见的有害菌，GOD在以葡萄糖为底物进行反应的过程中，一方面通过与葡萄糖作用而产生的葡萄糖酸来发挥降低pH值作用，酸性环境有利于乳酸杆菌等有益菌的生长繁殖，对大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌有抑制作用。黄建华等[6]研究了二甲酸钾对断奶仔猪大肠杆菌和乳酸杆菌的影响，结果表明二甲酸钾添加降低了断奶仔猪新鲜粪样中大肠杆菌数。另一方面，反应产生的少量过氧化氢能起到抑菌杀菌的作用，动物上的应用可有效改善消化道健康。杨久仙等[7]研究GOD对断奶仔猪胃肠道微生物区系以及生产性能的影响，结果显示与对照相比，饲粮中添加GOD提高了仔猪日增重，降低了消化道内大肠杆菌数量。GOD在反应过程中同时会消耗氧气，更易形成厌氧环境，大多数的有益菌是厌氧菌、有害菌是需氧菌，厌氧环境的形成更利于抑制肠道有害菌，促进有益菌的生长。笔者早期研究表明[5]，饲粮中添加GOD使仔猪粪便中沙门氏菌数显著低于对照组。从本试验结果可知，葡萄糖或者GOD在无底物葡萄糖存在的情况下琼脂板上无抑菌圈产生，只有当添加有底物葡萄糖时GOD才能发挥有效的抑菌效果。GOD对大肠杆菌和沙门氏菌抑菌圈直径都大于常用抗菌药物敏感性试验敏感度抑菌圈最低值（10～12 mm），这说明GOD对动物肠道内常见的大肠杆菌和沙门氏菌有较好的抑菌效果。GOD的产酸效果对pH值起到了很大降低作用。

4 结论

不同浓度和温度处理下，GOD混合液对大肠杆菌和沙门氏菌有较好的抑制效果；随着时间的变长，GOD产酸效果越明显。