二烯丙基三硫化物对内皮细胞缺氧复氧损伤的保护作用

过常发　孙笑天　王文硕　王春生

(1. 复旦大学附属中山医院心外科，上海　200032; 2. 复旦大学附属华山医院胸心外科，上海　200040)

·论著·

二烯丙基三硫化物对内皮细胞缺氧复氧损伤的保护作用

过常发1孙笑天2王文硕1王春生1

(1. 复旦大学附属中山医院心外科，上海200032; 2. 复旦大学附属华山医院胸心外科，上海200040)

摘要目的：探究以二烯丙基三硫化物为主要成分的大蒜素对心血管系统发挥保护作用的机制。方法： 以内皮细胞缺氧复氧模型为对象，采用细胞计数试剂盒(CCK8)评价内皮细胞活力的变化；用激光共聚焦显微镜测定内皮细胞线粒体膜电位的改变；将细胞接种于matrigel，观察血管形成能力的差异。结果： 二烯丙基三硫化物在质量浓度为0.2 μg/mL时对缺氧复氧损伤的保护作用最强，其主要机制是通过减少线粒体膜电位去极化水平使内皮细胞在经历缺氧复氧后仍维持正常的增殖分化能力。结论： 二烯丙基三硫化物通过线粒体途径减轻内皮细胞缺氧复氧的损伤。

关键词氧化应激；线粒体膜电位；增殖；分化

中图分类号R329.2

文献标识码

Protective Effect of Diallyl Trisulfide on Hypoxia-Reoxygenation Injury of Endothelial CellsGUOChangfa1SUNXiaotian2WANGWenshuo1WANGChunsheng1

1.DepartmentofCardiacSurgery,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China; 2.DepartmentofCardiothoracicSurgery,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China

AbstractObjective： To explore the mechanism of the protective effect of allicin, of which the main composition is diallyl trisulfide, on cardiovascular system. Methods： The endothelial cell model of hypoxia-reoxygenation injury was the research object. Vitality change of endothelial cells was evaluated by using CCK8. Confocal laser scanning microscope was used to detect the change of mitochondrial membrane potential in endothelial cells. Endothelial cells were planted onto matrigel so as to observe the difference regarding the ability of angiogenesis. Results： It showed that diallyl trisulfide performed the best protective effect at the concentration of 0.2 μg/mL, and its main mechanism based on maintaining the normal ability of proliferation and differentiation of endothelial cells after hypoxia-reoxygenation process by reducing the depolarization level of mitochondrial membrane potential. Conclusions： Diallyl trisulfide alleviates the hypoxia-reoxygenation injury of endothelial cells through the pathway involved with mitochondria.

Key WordsOxidative stress；Mitochondrial membrane potential；Proliferation；Differentiation

大蒜素及其组成成分在人体内能够发挥多种有益的生理作用，包括降脂、降压、抗血栓、增强免疫以及抗肿瘤作用[1-2]。多年来，人们探索了大蒜素制备产物在体内外对心血管疾病的防治作用[3]。随着硫化氢作为体内第三种重要气体信号分子被发现，大蒜素作为该气体分子的天然供体愈发受到重视[4]。在大蒜素的各种制备产物中，二烯丙基三硫化物(diallyl trisulfide，DATS)因其分子结构具有3个巯基而被认为抗氧化作用最强[5]。目前相关研究主要集中于DATS对心肌细胞的保护作用，而较少涉及其对于内皮细胞的保护作用。因此，本研究以脐静脉内皮细胞建立内皮细胞缺氧复氧细胞模型，探索DATS对内皮细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制。

1资料与方法

1.1试剂及器材新鲜脐带取自复旦大学附属妇产科医院，过程符合医疗伦理要求。F12培养基、胰酶、磷酸盐缓冲液(PBS)购自美国Gibco公司。内皮细胞培养基(ECM培养基)购自美国Sciencell公司。DATS、Ⅱ型胶原酶、JC-1探针购自德国Sigma公司。血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)抗体和CD31抗体购自美国Abcom公司。细胞计数试剂盒(CCK8)购自上海睿安生物科技有限公司。Matrigel购自美国BD公司。仪器设备：酶标仪(日本岛津公司)，共聚焦显微镜(日本Olympus公司)，细胞培养箱(美国Thermo公司)。

1.2建立内皮细胞缺氧复氧模型使用PBS将新鲜胎儿脐静脉内腔冲洗干净后注入含0.1% Ⅱ型胶原酶的F12培养基，37℃震荡消化15 min后收集消化液，以300×g离心5 min。去上清液后加入5 mL 内皮细胞培养基，重悬细胞后培养24 h，传代。采用免疫荧光染色法鉴定其中的vWF和CD31抗原，以评价所得内皮细胞的纯度。

将融合度为60%～70%的内皮细胞加入含不同浓度DATS(0.1、0.2、0.3、0.4 μg/mL)的内皮细胞培养基后，放入氧气浓度为1%的缺氧培养箱中静置1 h；更换新鲜内皮细胞培养基后恢复正常氧浓度并培养2 h，建立内皮细胞缺氧复氧模型。

1.3细胞活力检测采用CCK-8评价不同浓度DATS对内皮细胞缺氧复氧损伤的保护作用。将96孔板内复氧2 h后的内皮细胞每孔加入10 μL CCK8储存液，37℃孵育1.5 h后应用酶标仪读取各孔450 nm波长处的吸光度。将保护作用最大的DATS浓度处理的内皮细胞缺氧复氧模型作为DATS组，将未加DATS处理的内皮细胞缺氧复氧模型作为对照组。

1.4线粒体膜电位检测将各组内皮细胞消化后离心，然后用PBS重悬并加入线粒体膜电位探针JC-1至后者质量浓度为0.1μg/mL，37℃孵育15 min后，用PBS清洗以去除未结合的多余染料，应用激光共聚焦显微镜进行观察。JC-1的单体和聚合物所发出的荧光波长分别为530 nm和630 nm，用Imagero Plus计算细胞在两个波长处的荧光强度之比，后者代表细胞内线粒体膜电位的变化情况。

1.5体外血管形成实验在96孔板中每孔加入50 μL Matrigel，37℃孵育45 min后，加入含不同浓度DATS的内皮细胞培养液所重悬的3×104个内皮细胞，缺氧复氧处理后在37℃培养箱孵育8 h，随后在显微镜下观察。

2结果

2.1原代内皮细胞鉴定原代细胞接种后12 h即开始贴壁，24 h形成集落，融合为单细胞层后行免疫荧光染色。激光共聚焦显微镜下观察发现，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)所染的细胞核呈蓝色，而在其周围有CD31和vWF染色后所发出的绿色和红色荧光(图1)，提示该细胞内同时存在CD31和vWF两种内皮细胞特异性标志物，培养所得的为原代内皮细胞。

2.2DATS减轻内皮细胞缺氧复氧损伤缺氧复氧后的内皮细胞活力明显下降，而在缺氧复氧过程中添加DATS则可以保护内皮细胞。DATS对于内皮细胞的保护作用呈现剂量依赖性，在浓度为 0.2 μg/mL 时，DATS的保护作用最强。见图2。

2.3DATS减少线粒体膜电位损伤内皮细胞在缺氧复氧的过程中加入质量浓度为0.2 μg/mL的DATS后，在530 nm波长观察到的绿色荧光明显弱于对照组，而在630 nm波长观察到的红色荧光则明显强于对照组(图3)，这些结果提示，DATS可以明显减轻缺氧复氧过程中内皮细胞线粒体受到的损伤。

2.4DATS保护内皮细胞的血管形成能力内皮细胞接种于matrigel并经缺氧复氧之后，对照组的内皮细胞彼此分离，未能形成明显的管状结构；而经DATS处理的细胞表现出较高的分化程度并形成管状结构(图4)。

3讨论

本研究发现，DATS能够在缺氧复氧处理中对内皮细胞起到保护作用并呈现剂量依赖性。同时，本研究也发现，DATS发挥保护作用的机制与其减轻线粒体膜电位损伤有关。

DATS是脂溶性物质，能够穿透细胞膜进入胞浆，与胞浆中的谷胱甘肽反应，生成硫化氢，而后者被认为是DATS对于内皮细胞产生保护作用的主要物质。硫化氢可以促使线粒体膜表面糖原合成酶激酶-3β蛋白(glycogen synthase kinase-3β, GSK3β)的第9位色氨酸发生磷酸化，并抑制线粒体渗透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的开放，进而减轻缺氧复氧损伤所导致的线粒体膜电位去极化[6]。研究[7]表明，无论是在游离线粒体还是细胞中，内源性的硫化氢在线粒体电子运输和氧化磷酸化过程中都起到了重要作用。另外，硫化氢穿越线粒体膜后可以减轻氧化物对线粒体DNA的损伤[8]。

内皮细胞功能障碍在细胞层面主要表现为增殖及迁徙功能低下。本实验发现DATS能够明显改善内皮细胞经历缺氧复氧损伤后的体外血管形成能力。与之相一致的是，硫化氢同样可以以剂量依赖的方式促进血管形成[9]。硫化氢可以激活ERK1/2和P38通路[10]，而这两条通路在内皮细胞增殖及维持自身稳态方面发挥着重要作用。此外，硫化氢还可以通过开放KATP通道来发挥对细胞的保护作用，此种通道广泛存在于细胞膜和细胞器内[11]。

综上所述，大蒜提取物DATS进入细胞后通过释放硫化氢而在特定的浓度发挥抗缺氧复氧损伤的作用。这一新作用的发现为大蒜素应用于移植器官保护和缺血性疾病的治疗提供了依据。

参考文献

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基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：81270326)