利斯的明中间体立体拆分菌株的筛选与鉴定

周方方， 付路平， 李永红,2

(1.郑州大学 药学院 郑州 450001;2.郑州大学 新药研究开发中心 郑州 450001)

利斯的明中间体立体拆分菌株的筛选与鉴定

周方方1， 付路平1， 李永红1,2

(1.郑州大学 药学院 郑州 450001;2.郑州大学 新药研究开发中心 郑州 450001)

自土壤中筛选出44株能够拆分利斯的明的菌株.通过薄层色谱、高效液相及核磁分析发现一株菌种编号为Rnn02的菌株对利斯的明外消旋物的拆分效率最高.通过菌株形态学及18S rRNA基因序列分析确证该菌株为季也蒙毕赤酵母(Meyerozymaguilliermondii).

利斯的明； 拆分； 鉴定

0 引言

利斯的明(Rivastigmine)，又称卡巴拉汀，化学名(S)-N-乙基-[3-(1-二甲基氨基)乙基]-N-甲基-氨基甲酸苯酯，结构式如图1，是氨基甲酸酯类脑选择性乙酰胆碱酯酶抑制剂，能够选择性地作用于大脑区域内并且有长持续时间的活性[1-2].

利斯的明的酒石酸盐的商标名称为艾斯能(Exelon).它对轻中度阿尔茨海默症(AD)有温和节制效果，对震颤麻痹[3]和路易小体[4]引起的痴呆症以及血管性痴呆[5]也同样具有良好的治疗效果.临床研究证明其耐受性和安全性较好，无肝脏毒性，是唯一不经过P450代谢的药物，其疗效较其他胆碱酯酶抑制剂更好.

近几年随着酶固定化、生物反应器等多种生物技术的飞速发展，生物拆分中的酶法具有副反应少、立体选择性强、拆分效率高、成本低、周期短、不受季节影响、能重复利用、可大规模生产并且环保等优点，因此在手性化合物制备中逐渐引起大家的极大兴趣.在今后，化学法与酶法的结合将是制备手性化合物的新切入点.文献[6]在2009年报道了化学-酶法制备S型利斯的明的方法，反应条件温和、产率(77%)及光学活性较高(ee值97%)，但动态动力学拆分(DKR)所用金属钌配合物及脂肪Novozym-435价格昂贵.因此，筛选立体选择性强、催化效率高且稳定性好的微生物酶，并在此基础上开发出具有自主知识产权的制备S型利斯的明的新工艺，具有重大意义.本文筛选出一株可以高效拆分利斯的明中间体的菌株，意义重大，有应用于工业化的潜质.生物拆分所用的酶大部分由微生物产生，因此本研究旨在筛选合适的微生物，为利用化学-酶法制备利斯的明的研究做准备.

1 材料与方法

1.1 仪器

核磁共振(瑞典Bruker DPX-400型超导核磁共振仪)，高效液相色谱(Waters 1525).HYG-Ⅱa 型自动摇瓶柜(上海欣蕊自动化设备有限公司)，R-1005型旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司)，Waters 1525高效液相色谱仪，色谱柱为Lux 3u Cellulose-1柱(4.6 mm×250 mm×3 μm，美国Phenomenex公司)， DP-88型SensoQuest LabCycler系列PCR仪.

1.2 材料与试剂

底物(化学物2)自制，利用HPLC图谱通过归一化法计算纯度为98.3%，琼脂粉、蛋白胨、酵母膏、丙酮、葡萄糖、乙酸乙酯及其他试剂均为分析纯.

1.3 菌株的筛选和鉴定

1.3.1 样品来源 从郑州、南阳、南宁、柳州、济南、北京6个地区采集到富含油脂的6份土样.

1.3.2 培养基 斜面保藏培养基(g/L)：酵母浸膏2，蛋白胨5，琼脂23，葡萄糖10， pH自然.

富集培养基(g/L)：酵母浸膏2，蛋白胨5，葡萄糖10，pH自然.

平板分离培养基(g/L)：以底物为唯一碳源，NH4NO31.0，底物10，NaCl 10.0，K2HPO41.5， KH2PO40.5，MgSO40.2，琼脂23， pH自然.

罗丹明B选择培养基(g/L)：橄榄油15，酵母膏20，蛋白胨50，琼脂粉23，罗丹明B 2， pH自然.

斜面保藏LB培养基(g/L)：酵母膏 5，蛋白胨10，NaCl 10，琼脂20，pH 7.5.

转化培养基(g/L)配方：玉米浆5，蛋白胨10，蔗糖20， pH 8.0(Tris-HCl缓冲体系).

配制方法见文献[7-13].

1.3.3 菌株的筛选 1) 称取1.5 g土样，溶于无菌水中，振荡器震荡10 min后，将上层清液倒入富集培养基中培养48 h.

2) 将1)中培养液用无菌水稀释后，涂布至以底物为唯一碳源的选择性平板上，于28 ℃培养.

3) 将2)中长出的菌落挑出，分离纯化至单菌落.

4) 将3)中纯化后的菌种用罗丹明B指示平板，28 ℃培养48 h后，进行复筛.在365 nm紫外灯下观察，产脂肪酶的菌株周围有红色的荧光环.

5) 将4)中筛选出的菌种摇瓶发酵培养后，加入0.1% 底物进行拆分试验，用TLC法检测有无产物生成，保留有产物点的菌株.

6) 将5)中筛选出的菌种经摇瓶发酵培养后，加入0.1%底物进行拆分试验，用乙酸乙酯萃取3次后，蒸干溶剂，用HPLC法检测产物的ee值，选出ee值最高的菌种保留.

7) 将拆分产物经柱色谱提纯后用核磁共振仪(NMR)测定其结构.

根据TLC、HPLC和NMR结果确定目的菌株.

1.3.4 转化条件 以10% 的接种量将培养48 h后的种子液转接入含110 mL 液体培养基的三角瓶中，于28 ℃，220 r/min条件下培养16 h.发酵液以5 000 r/min 离心10 min，得到的湿菌体用缓冲溶液洗涤后悬浮于相同的缓冲液中，加入底物后在相同条件下进行转化16 h.

利斯的明和中间体的拆分是由微生物菌体中的脂肪酶催化的，酶催化受各种因素调控.因此脂肪酶活性并不能更好地表示优化效果，故用转化率来表示转化效果.用转化16 h后目的产物量占加入底物量的百分比来表示转化率.

1.3.5 菌株的鉴定 菌落形态特征按常规方法进行[14].在初步判断菌种类型的基础上，采用分子生物学鉴定方法以其18S rRNA进行基因序列分析，PCR扩增并测序，引物设计及反应参数参照文献[15].在NCBI数据库中将测序结果Blast比对分析，进行最后鉴定.

1.4 菌株转化产物的分析和计算方法

1.4.1 转化产物的提取 用相同体积乙酸乙酯萃取转化液3次，得到乙酸乙酯相，用饱和的NaHCO3洗3次，饱和NaCl溶液洗3次，最后再用蒸馏水洗1次.将得到的饱和NaHCO3相和饱和NaCl相用乙酸乙酯反萃取一次.合并所有有机相，无水Na2SO4干燥后用TLC和HPLC法测定.

1.4.2 TLC分析方法 将样品点于硅胶GF254薄层板上，氯仿∶甲醇(10∶1，V/V)为展开剂进行检测.

1.4.3 HPLC分析方法及ee值计算方法 固定相为手性Lux 3u cellulose-1柱，正己烷-异丙醇(92.5∶7.5)为流动相，检测波长217 nm，柱温25 ℃，流速0.8 mL/min进行HPLC分析.据样品在HPLC图谱中的峰面积计算ee值.公式为：

eeR(%)=(R异构体峰面积-S异构体峰面积)/(S异构体峰面积+R异构体峰面积)×100%.

2 结果与讨论

2.1 菌株的筛选

经过初筛得到能够在以底物为唯一碳源的平板上生长的44株菌株，用LB斜面培养基保藏菌种，用于后续研究.

采用罗丹明B平板筛选法[16-17]对初筛出的44种菌株进行复筛，由于脂肪酶或酯酶可将平板上的油脂降解产生脂肪酸，脂肪酸可以与罗丹明B阳离子发生反应，形成的物质在紫外灯下显现橙黄色荧光现象(如图2).因此若菌株产生脂肪酶或酯酶，其周围会出现荧光圈，罗丹明B平板筛选法筛选出19株有荧光的菌株.

分别将罗丹明B平板筛选法筛选出有荧光的19种菌株进行摇瓶发酵培养，转化底物，用乙酸乙酯萃取转化液，然后用薄层色谱法进行产物监测，从中得到14株有产物点出现的菌株.分别将薄层色谱法筛选出的14种菌株摇瓶发酵培养，转化底物，用HPLC法进一步测定，结果如表1所示.

由表1所示，编号Rnn02的菌株ee值和转化率均较好，菌株Gxnno2B、Gxnno1A和zz03虽然转化率较高，但是ee值过低，菌株zz01C的ee值虽然较高，但是转化率较低.综合考虑Rnn02菌株对外消旋底物的拆分效果最好，可能是符合要求的菌株.

2.2 高效拆分菌株的确定

2.2.1 HPLC法验证 利用Rnn02菌株催化拆分的反应体系(包括反应底物和产物)和利用文献中所用的Novozym453酶催化拆分的反应体系的HPLC色谱保留时间进行比较(见表2，图3和图4).

从图4及表2可以看出新出现化合物(R)-1和化合物(R)-2的峰面积小于(S)-2的峰面积，说明化合物(R)-2部分转变成(R)-1，而(S)-2的峰面积基本不变，且没有(S)-1的峰出现，说明得到的拆分产物是化合物(R)-1.HPLC谱图前面基线不太平稳，这是由于所用的正己烷和异丙醇均为分析纯，保留时间小于8 min的峰是溶剂中含的杂质.对化合物1、化合物2及消旋化合物1转化12 h后产物的HPLC谱图结果分析得出，化合物1的R-异构体和S-异构体保留时间分别为(17.045±0.3) min和(14.618±0.2) min，化合物2的R-异构体和S-异构体保留时间分别为(10.334±0.3) min和(12.037±0.3)min.

2.2.2 核磁氢谱对比分析 转化产物的1HNMR谱图解析显示：1HNMR(400MHZCDCL3),d7.31(t,1H,Ar-H),d7.17(d,1H,Ar-H),d7.12(s,1H,Ar-H),d7.00(d,1H,Ar-H),d4.86(q,1H,PHCHCH3),d3.42(dq,2H,NCH2CH3),d3.14(d,3H,NCH3),d2.2(s,1H,OH),d1.44(d,3H,PHCHCH3),d1.22(dq,3H,NCH3).

为进一步确定进行拆分的化合物的种类，将转化产物的1HNMR谱图与化合物(R)-2的1HNMR谱图进行比较分析(见图5)，发现两张谱图完全一样，因此进一步确定转化拆分的是(R)-2.

通过对拆分反应底物和产物的HPLC保留时间及核磁氢谱的研究，从而确定编号Rnn02的菌株是符合本研究要求的菌株.

2.3 菌株的鉴定分析

菌株在不同培养基上具体形态不同，通过观察菌落形态、菌体形状和大小、有无孢子和菌丝生成以及繁殖方式对菌种进行初步鉴定.Rnn02菌株在不同培养基上的共同特征如下：呈乳白色，表面褶皱，有光泽，湿润，无孢子和假菌丝，呈黏稠状，无特殊气味，细胞有椭圆形(4 μm×4.5 μm～5.5 μm×6 μm)和圆形(4.5 μm)两种类型.生长方式多数为裂殖，少部分为芽殖.根据编号Rnn02的菌株的细胞形态和菌落形态的结果及与相关资料对比，初步判断该菌为酵母菌.

最后用分子生物学手段做最终鉴定.以酵母菌保守序列18S rRNA进行基因序列分析，PCR扩增并测序.在NCBI数据库将测序结果用Blast比对同源分析.鉴定出该菌为季也蒙毕赤酵母(Meyerozymaguilliermondii).

3 结论

经过初筛、复筛，通过TLC、HPLC、NMR分析发现一株编号为Rnn02的菌株对利斯的明中间体外消旋物的拆分效率最高.经菌落形态分析及分子生物学手段确定为季也蒙毕赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)，并已于2012年12月7日经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.6783.该菌株可对手性中心含有酰基或羟基的化合物进行对映体拆分，拆分所得产物单一，拆分效率高，价格低廉，工艺简单，有应用于工业化生产的潜力.

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(责任编辑：王浩毅)

Screening and Identification of Strains for Rivastigmine Intermediates Stereo-resolution

ZHOU Fangfang1, FU Luping1， LI Yonghong1,2

(1.SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China; 2.NewDrugResearch&DevelopmentCenter，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001,China)

The screening of 44 strains from soil that could resolute Rivastigmine was conducted. By using TLC, HPLC and NMR analysis methods, a strain numbered Rnn02 was identified, which had the highest resolution efficiency for racemic Rvastigmine. It was identified to beMeyerozymaguilliermondiiby morphology and it’s 18S rDNA analysis.

Rivastigmine; resolutiont; identification

2015-07-04

国家自然科学基金资助项目，编号21402178.

周方方(1990—)，女，河南许昌人，硕士研究生，主要从事微生物药物研究；通讯作者：李永红(1970—)，女，河南安阳人，博士，副教授，主要从事微生物药物研究，E-mail：lyh224@163.com.

周方方，付路平，李永红.利斯的明中间体立体拆分菌株的筛选与鉴定[J].郑州大学学报：理学版，2015,47(4)：71-75.

TQ460.1

A

1671-6841(2015)04-0071-05

10.3969/j.issn.1671-6841.2015.04.014