脂肪干细胞提取方法的改良

胡金灵　邵世飚　梁廷波

·实验研究·

脂肪干细胞提取方法的改良

胡金灵邵世飚梁廷波

目的 探索一种简单高效的脂肪干细胞提取方法。方法 实验动物选取SD大鼠，在传统脂肪干细胞提取方法的基础上提高胶原酶浓度并省略裂解红细胞及筛网滤过步骤作改良，比较两种提取方法所用时间、提取的脂肪干细胞数量、生物学特性、传代及分化能力等。结果 改良法提取脂肪干细胞用时70min，提取5瓶原代细胞，未污染，细胞3d后传代，子代细胞生长良好，成功诱导分化为脂肪细胞。结论 改良法提取脂肪干细胞能够显著增加细胞提取数量，缩短提取时间，降低原代细胞污染率，不影响细胞生物学特性及分化能力，是一种简单高效的脂肪干细胞提取方法。

脂肪干细胞 改良 提取

各种急慢性肝病已经成为危害人类健康的重要疾病，目前世界上对于肝病的治疗主要采取维持和支持疗法，肝移植因供体的缺乏、费用昂贵以及尚存在免疫排斥等问题尚未解决。近年来，人们发现脂肪组织中含有一种多功能干细胞，即脂肪干细胞（adiposederived stem cells ADSCs），它不仅在细胞生长动力学，细胞衰老、基因转导和横向分化能力等方面与骨髓间充质干细胞（mesenchmal stem cells MSCs）非常相似，且还具有来源广泛，容易大量获得，取材方便，给患者带来的痛苦小等优点［1～3］。作者自2010年8月至2013年8月在脂肪干细胞提取过程中，经过反复实验和不断改进，摸索出一种比较理想的提取方法，现介绍如下。

1　材料与方法

1.1实验动物与材料 成年SD大鼠，雌雄不限，200g左右，由浙江省医学科学院提供。Ⅰ型胶原酶、油红O、胰岛素、地塞米松、吲哚美辛、异丁基甲基黄嘌呤均购自美国Sigma公司；胎牛血清（FBS）、DMEM培养基购自美国Gibco公司；CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜购自日本Olympus公司。基础培基：DMEM+10%FBS+100U/ml青霉素+100U/ml链霉素，诱导培养基：DMEM+10%FBS+100U/ml青霉素+100U/ml链霉素+10μg/ml胰岛素+1μmoL/L地塞米松+0.5mmoL/L异丁基甲基黄嘌呤+200μmoL /L吲哚美辛。

1.2实验方法 （1）脂肪碎片制备：动物称重后，水合氯醛过量麻醉处死，无菌条件下取出腹股沟处脂肪垫，尽量剔除软组织和小血管，PBS缓冲液冲洗3～5次。将脂肪组织剪成小块，PBS缓冲液反复冲洗，制备两等份脂肪组织碎片。（2）脂肪干细胞传统提法：将上述一份脂肪组织碎片在37℃下由0.075%I型胶原酶消化60min，含10%FBS的DMEM 等体积中和，1000转/min离心10min后弃去上清液，160mmol/L NH4Cl裂解红细胞10min，离心弃去上清液，含10%FBS的DMEM重悬细胞，200目筛网过滤后离心，基础培养基重悬后分别接种至3只培养瓶。48h后第一次换液，此后每3d更换培养基，细胞生长至亚融合状态时传代，37℃下0.25%胰酶消化，离心弃上清液，基础培养基重悬细胞，细胞悬液1：2接种至培养瓶，每3d更换培养基。（3）脂肪干细胞改良提法：将上述另一份脂肪组织碎片在37℃下由0.25%I型胶原酶消化30min（消化开始，计时器开始计时），含10%FBS的DMEM等体积中和，1000转/min离心10min后弃去上清液，基础培养基重悬细胞后分别接种至5只培养瓶（计时器停止计时）。48h后换液，除去未贴壁细胞，此后每天更换培养基，细胞生长至亚融合状态时传代，37℃下0.25%胰酶消化，离心弃上清液，基础培养基重悬细胞，细胞悬液1：2接种至培养瓶，每3d更换培养基。（4）细胞提取后处理：定时在倒置相差显微镜下观察两种方法提取的原代干细胞及子代干细胞，并拍照记录。（5）脂肪干细胞成脂诱导：子二代细胞长至亚融合状态时，37℃下0.25%胰酶消化，离心弃上清液，基础培养基重悬细胞，行细胞爬片，2d后更换诱导培养基，每3d更换诱导培养基。诱导后1周行油红O染色。

2　结果

2.1从计时开始，传统方法提取脂肪干细胞用时128min，新方法提取干细胞用时70min，新方法较传统法缩短58min。

2.2传统方法提取的3瓶原代ADSCs，1瓶污染（培养液混浊，见大量细菌生长），2瓶未见污染，污染百分比33.3%；改良法提取的5瓶原代ADSCs均未污染，污染百分比为0%。

2.3未污染原代ADSCs的生物特性 细胞接种4～6h后镜下可见少量呈圆形或类圆形的细胞开始贴壁，24h后干细胞大多已贴壁，并开始伸展，多呈梭形，胞质中可见脂滴。48h后贴壁细胞开始分裂增殖，多呈成纤维细胞样，细胞汇合成单层，排列出现方向性。

2.4脂肪干细胞培养及传代情况 镜下可见每瓶改良方法提取的原代脂肪干细胞数量均明显多于每瓶传统方法提取的原代脂肪干细胞数量，培养液中的杂质也是新方法中的较多，随着换液和传代，视野中的杂质逐渐减少。改良方法提取的原代干细胞3d后长至亚融合状态，可传代，而传统方法提取的原代干细胞5d后方可传代。两种方法提取的细胞1：2传代后增殖速度及生物特性上无明显差别，均为传代后4～6h开始贴壁，经过较短的潜伏期后开始增殖，约每3d传一代。

2.5脂肪干细胞成脂诱导 对两种方法提取的第二代脂肪干细胞进行成脂诱导，行油红染色O染色后两者均诱导成功，无明显差别。

3　讨论

在目前肝脏来源短缺的情况下，如何使受损肝脏再生从而恢复正常肝功能对晚期肝病患者十分重要。干细胞的获取和培养是首先需要解决的问题。2001年Zuk等［1］首次从脂肪组织中提取并培养出ADSCs后，众多的研究发现ADSCs具有和MSCs相似的生物学特性，在相应的诱导环境下可以向骨细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、神经元细胞及肝细胞分化［4～12］，表现出成体干细胞的横向分化能力。此外，ADSCs还具有取材方便、分布广泛等MSCs所不具有的优点，因此ADSCs可以作为干细胞移植的首选种子细胞，有非常重要的研究和应用价值。

脂肪干细胞传统提取方法步骤多，随之带来了提取时间长，容易污染，提取过程中细胞损失量多等诸多问题。在提取脂肪干细胞的过程中，胶原酶主要起到消化脂肪组织中的胶原组织，使细胞松散，便于干细胞脱落的作用。一定程度上提高胶原酶浓度，缩短消化时间，既可以显著增加干细胞提取量，又可以减少操作时间，降低污染可能性，也不会出现干细胞生物学特性和分化能力的改变。此外，NH4Cl主要作用是裂解红细胞，如果浓度或裂解时间控制不佳，会对干细胞造成损害，可能会影响干细胞提取的数量和干细胞的生物学特性及分化潜能；筛网滤过是物理性过程，主要目的是将细胞悬液中的一些比较大块的组织碎片去除，过滤的过程必定伴随着干细胞的损失和污染可能；脂肪干细胞提取过程中每增加一个步骤，就会增加一次细胞悬液离心过程，离心的过程也会造成细胞丢失和一定程度的损害。由此，将NH4Cl裂解红细胞及筛网过滤悬液去除脂肪组织的步骤省去，这会造成视野不清晰，对干细胞的观察不能达到十分理想的效果，但目前对原代脂肪干细胞生物学特性的了解已经十分深入，因此原代干细胞视野欠清并不会对实验研究造成限制性影响。

本资料结果显示，改良法提取脂肪干细胞能够显著的增加细胞提取数量，缩短提取时间，降低原代细胞污染率，且不会影响细胞生物学特性及分化能力，是一种简单有效的脂肪干细胞提取方法。

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4 Zuk PA, Zhu M, Mizuno H.Multilineage cells from human adipose tissue：implications for cell-based therapies.Tissue Eng, 2001,7（2）：211～228.

5 Lee JH, Kemp DM.Human adipose-derived stem cells display myogenic potential and perturbed function in hypoxic conditions.Biochem Biophys Res Commun, 2006, 341（3）：882～888.

6 Bai X, Pinkernell K, Song YH, et al.Genetically selected stem cells from human adipose tissue express cardiac markers.Biochem Biophys Res Commun, 2007, 353（3）：665～671.

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10 Xu Y, Liu Z, Liu L, et al.Neurospheres from rat adipose-derived stem cells could be induced into functional Schwann cell-like cells in vitro. BMC Neurosci, 2008, 9（1）：21.

11 Huang T, He D, Kleiner G, Kuluz J.Neuron-like differentiation of adipose-derived stem cells from infant piglets in vitro.J Spinal Cord Med, 2007, 30（Suppl 1）：S35～S40.

12 Banas A, Teratani T, Yamamoto Y, et al.Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a source of human hepatocytes.Hepatology, 2007, 46（1）：219～228.

·诊治分析·

Objective Explore a simple and efficient extraction method of adipose-derived stem cell. Methods A comparison was made between an improved method and the conventional method, the former increased concentration of collagenase and saved the steps of erythrocyte lysis and fi ltration by screen on the basis of traditional method. Adipose-derived stem cells were respectively isolated by traditional method and improved method. Extration time and the quatity， biological characteristics and differentiation potential of adipose-derived stem cells were compared. Results the time for improved method was 70 minutes. There was no contamination in the fi ve cell bottles containing a lot of impurity. The time needed to passage was 3 days and the cells passaged grew well and were induced to adipocyte successfully. While the time for traditional method was 128 minutes. There was contamination in one cells bottle out of three bottles containing a little of impurity. The time needed to passage was 5 days and the cells passaged grew well and were induced to adipocyte successfully. Conclusion The modifi ed method can signifi cantly increase the quality of the extracted cells，shorten the extracting time and decrease the contamination rate of primary cells， while it would not affect the cell biological characteristics and the differentiation potential. So the method was simple and effective.

Adipose-derived stem cells Improved Extract

313300 浙江省安吉县人民医院（胡金灵 邵世飚）310028 浙江大学医学院附属第二医院（梁廷波）