内皮祖细胞治疗缺血性脑血管病的研究进展

李雨浓，朱雨岚

目前公认的缺血性脑血管病的治疗方法是以重建超急性期缺血区的脑血流为目的的药物治疗及机械再灌注治疗[1]。尽管静脉给予重组组织型纤溶酶原激活剂（recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA）溶栓治疗是有效的，但仅有不超过5%的缺血性脑血管病患者成功接受治疗[2]。因此，寻求其他切实有效的治疗方法对于那些处于非超急性期的缺血性脑血管病患者具有更重要的意义。在亚急性期，通过促进脑损伤区毛细血管新生，可以促进神经再生及缺血损伤后的脑功能恢复，改善患者的生存质量[3]。目前促进血管新生及神经发生已成为缺血性脑血管病治疗的重要思路和新途径，而内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）可以促进内皮细胞生成和神经发生，参与缺血性脑血管病的发病，为缺血性脑血管病的治疗提供了新的方向。

1 EPC的作用及机制

缺血性脑血管病主要由于脑组织局部血循环缺乏以及神经元坏死而造成难以逆转的功能破坏，而组织缺血引起的血管新生构成了可以维持器官生理功能灌注量的宿主防御反应。EPC具有类似胚胎成血管细胞的功能，除促进血管新生外，还可以促进神经发生。

1.1 促进血管新生的机制 从成人或成年动物的外周血中分离出源自骨髓的循环EPC细胞群体，根据EPC在培养过程中出现的时间大致将EPC分为早期EPC和晚期EPC，两者通过不同的机制促进血管新生。早期EPC具有强大的分泌功能，主要通过分泌多种细胞因子促进血管新生。Rehman等[4]从人外周血中分离获得早期EPC，将其接种于无生长因子的培养基中培养72 h后对培养基进行血管新生相关生长因子的鉴定，发现早期EPC并无明显的增殖，但却释放了大量的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、粒细胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF）等细胞因子。此外，Urbich等[5]将早期EPC（实验组）和脐静脉内皮细胞（对照组）分别置于等量的培养基质中培养24 h后，用酶联免疫吸附试验检测培养基质中的细胞因子，发现与脐静脉内皮细胞相比，EPC培养基质中的VEGF、HGF等细胞因子释放明显增多。研究者将二者的培养基质浓缩，继续用其进行内皮细胞划痕实验，发现实验组较对照组内皮细胞迁移及增殖程度显著增加，但当向培养液中添加VEGF等细胞因子中和抗体后，实验组的促迁移效应被明显抑制，可见早期EPC可通过分泌细胞因子介导内皮细胞增殖与迁移，增强了生成血管的能力。

晚期EPC因其激酶插入嵌合受体（kinase insert domain receptor，KDR）、血管内皮钙黏蛋白（vascular endothelial-cadherin，VE-cadherin）等EPC表面标记的表达高于早期EPC的表达，它可通过以下两种机制促进血管新生：①VE-cadherin介导内皮细胞间的黏附作用，晚期EPC中VE-cadherin表达增强使其可以更好地并入单层内皮细胞，增加内皮细胞的数量，从而促进血管新生[6]；②KDR介导VEGF激活内皮细胞，晚期EPC中KDR表达增强导致由VEGF介导的内皮细胞增殖、出芽及移行能力增强，内皮细胞小管管腔形成增加[7]。由此可见，早期和晚期EPC通过不同的机制均达到了促进血管新生的目的，也因此有希望使其成为针对缺血性脑血管病的细胞治疗手段。

1.2 促进神经发生的机制 在缺血后的神经发生中，EPC可通过分泌细胞因子促进神经发生。在体内试验中，Rosell等[8]经静脉注射含EPC分泌因子的培养基质于一侧大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）的大鼠体内，结果发现，同未给予培养基质静脉注射的MCAO对照组大鼠相比，给予培养基质静脉注射的MCAO大鼠脑梗死周围区出现神经轴索重组，成神经细胞迁移也更加明显。在体外试验中，研究者共培养EPC和神经干细胞（neural stem cell，NSC）于transwell小室中作为实验组，该组中NSC接种于transwell 6孔板下层，EPC接种于上层，二者以聚碳酸酯膜相隔，使两种细胞不能相互混合，以避免EPC细胞本身干扰NSC增殖，但其分泌的细胞因子可通过该膜，为确保NSC的增殖与分化仅受EPC分泌因子的影响，将上下层单纯培养NSC设为对照组，4 d后发现实验组较对照组NSC的数目明显增多，7 d后实验组NSC分化率明显高于对照组，该实验证实了EPC可通过产生分泌因子促进NSC的增殖及分化，促进神经发生[9]，但具体为哪种细胞因子尚需进一步检测。此外，EPC也通过促进血管新生有利于神经元形成及存活。Thored等[10]在大鼠MCAO后，分别于第2、6、16周观察到在大鼠脑梗死周围区成神经细胞沿新生血管移行实现神经发生，新生血管为神经发生提供了有利环境。齐志国等[11]在MCAO大鼠的缺血半暗带区单纯移植NSC或共移植NSC和EPC，3 d后发现接受共移植的MCAO大鼠（共移植组）较未接受移植及单纯移植NSC的MCAO大鼠缺血半暗带区血管密度增加，通过大鼠行为学检测发现共移植组较单纯移植NSC或EPC的MCAO大鼠神经功能改善更明显。7 d后将大鼠颅骨钻孔在伤侧皮层区域及对侧肢体安放电极记录运动诱发电位，发现共移植组较单纯移植NSC或EPC的MCAO大鼠运动诱发电位恢复更显著，可见EPC可促进血管新生，其与NSC共移植后更有利于神经功能的恢复，研究者推测其机制可能为新生血管对神经具有营养作用并且增强了对神经元有害物质的清除能力，降低了神经元的凋亡，从而促使缺血区神经功能的恢复。

2 以EPC为基础的治疗策略

以EPC为基础的治疗策略分为外源性EPC的移植及内源性EPC的动员、EPC分泌因子的“无细胞”治疗，现从这三方面展开阐述。

2.1 外源性EPC的移植 动物研究发现，移植外源性EPC可对缺血性脑血管病起到治疗作用。Taguchi等[12]将易卒中型自发性高血压幼鼠的骨髓源性EPC经骨髓腔移植到实验性脑缺血后的成年大鼠体内，移植后30 d观察发现，脑梗死周围区微血管密度增加，缺血性脑损伤降低，大鼠神经功能有所改善。Moubarik等[13]将人脐带血源性的EPC同种亚型经股静脉注入MCAO大鼠体内，24 h后EPC定位于大脑缺血区的内边界，14 d后发现注入人脐带血源性的EPC同种亚型的MCAO大鼠较未注入人脐带血源性的EPC同种亚型的MCAO大鼠神经功能明显改善，缺血导致的细胞凋亡减少，缺血区周围有新生血管神经形成。Chen等[14]给MCAO兔子静脉注射体外扩增的自体EPC，14 d后发现注射自体EPC的MCAO兔子梗死灶中血管新生及神经形成较静脉注入等量磷酸盐缓冲盐液的MCAO兔子显著。Fan等[15]将EPC经静脉注射至MCAO后1 h的小鼠体内，3 d后发现脑梗死体积较无EPC静脉注射的对照组小鼠梗死体积缩小，4周后小脑皮质萎缩程度较对照组降低，梗死周围区存在神经及血管新生，神经行为表现有明显改善。

另有研究表明，移植外源性EPC还可通过治疗脑血管病危险因素造成的血管损伤来延缓脑血管病进展，预防缺血性脑血管病的发生。高血糖和高胆固醇等脑血管病危险因素均可造成血管内皮的损害，并使血循环中EPC的数量和功能降低[16-17]。经体内试验证实，给予实验性糖尿病致后肢缺血大鼠肌注EPC，28 d后缺血后肢存在明显血管新生[18]，高血糖造成的血管损害得到一定程度的修复；给予经高脂饮食5周后小鼠静脉注射EPC，1周后发现血管舒张功能有所改善，一氧化氮合酶的活性提高，对预防早期的血栓形成具有一定作用[19]。

此外，已有研究证实在心肌、骨骼肌等其他组织缺血性疾病中通过移植前对EPC进行基因转染、缺氧预处理等体外修饰可加强移植后的治疗效果[20-23]，虽然修饰后的EPC移植尚未应用于脑缺血实验中，但上述研究展现了修饰后EPC的治疗优势，为缺血性脑血管病的治疗研究提供了新的思路。

2.2 内源性EPC的动员 利用药物及其他方法使内源性EPC的动员、迁移等行为增强可达到治疗缺血性脑血管病的目的。Qin等[24]向大鼠侧脑室内注射趋化因子增加了内源性EPC在缺血半暗带中迁移的数量，梗死周围血管的密度及神经元的存活数呈剂量依赖性增加，降低了大脑损伤。运用电针刺激疗法可促进EPC的动员、趋化及归巢等行为，降低了诱导性一氧化氮合酶活性，增加了VEGF水平，促进了脑缺血后血管新生，从而治疗缺血性脑血管病[25]。此外，他汀类药物、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂等药物也可促进EPC的动员，增加其数量[26-28]，从而增加心肌缺血区新生毛细血管的密度，但在脑缺血中的这种作用有待进一步证实。

2.3 EPC分泌因子的“无细胞”治疗 EPC可释放生长因子等旁分泌因子，这些分泌因子可抑制细胞凋亡，促进已分化的内皮细胞迁移和增殖，促进血管新生。有学者认为，促进新血管的形成不仅依赖于EPC的细胞治疗，单独应用EPC的分泌因子也可发挥明显的治疗作用[29]。静脉给予MCAO小鼠EPC的培养介质（含EPC分泌因子），结果发现脑梗死周围区的毛细血管密度显著增加，小鼠前肢的力量也得到改善[8]。有研究将直接移植EPC分泌因子和单纯移植EPC相比较，发现有相同的治疗效果，而前者需要的EPC细胞数量少于后者，且同时避免了细胞移植造成的不良反应[30]。因此，有学者提出应用分泌因子这种“无细胞”治疗策略或许优于EPC细胞移植，在未来的脑血管病治疗策略中，EPC分泌因子的“无细胞”治疗可能成为更安全有效的选择。发病后72 h、7 d及90 d后的神经功能缺损情况，通过改良Rankin量表（modified Rankin Scale，mRS）评分在患者发病3个月后评价患者的临床预后，通过逻辑回归及线性模型等方法对结果进行分析，发现发病后1周循环EPC水平越高，患者的NIHSS评分改善越明显，梗死进一步发展的面积也越小，mRS评分越低，临床预后佳。相反，脑梗死48 h后，循环EPC水平较低提示神经功能缺损严重，预后不良[33]。

3 EPC对缺血性脑血管病的预测价值

EPC对缺血性脑血管病的预测价值主要体现在EPC作为脑血管功能的标志物对缺血性脑血管病严重性及临床预后的预测作用。通过对中国急性脑梗死患者的临床研究发现[31]：急性脑梗死患者EPC数量明显低于健康人，且EPC水平的下降与脑血管病危险因素有关，体重指数、年龄、收缩压、舒张压、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯、总胆固醇及血糖水平与EPC数量呈负相关，其中收缩压、总胆固醇和甘油三酯水平可作为EPC水平的独立预测因子。EPC与上述多种危险因素结合通过多变量统计分析方法可预测脑梗死发生的可能性，通过流式细胞仪精确测量循环EPC的数量可估计脑血管病的严重性及证明导致内皮损伤的危险因素的存在。此外，急性脑梗死后第1周患者的EPC数量和患者3个月后的临床预后相关，Tomas等[32]纳入48名首次出现脑梗死症状且发病12 h内的患者，通过美国国立卫生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）评分分别评估患者在入组时，

4 应用EPC目前存在的问题

尽管关于EPC作用机制和治疗方法的研究已经取得了一些进展，但是仍存在一些问题需要更深入的研究：①在临床实践中，细胞移植疗法可导致一些不良反应，包括微血栓形成、肿瘤形成、肺功能紊乱、免疫反应异常等疾病[34]。②在动物实验中，经静脉给予EPC细胞移植仅表现出短期的神经功能恢复，是否通过其他给药途径（如颅内给药）延长修复期尚有待证实，且最佳的给药途径存在一定争议。③外围血中EPC的数量非常少，而将小鼠经MCAO处理后早期外周血EPC出现暂时降低[35]，据推测可能因外周血中的EPC定向迁移至缺血区，骨髓尚不能代偿性动员EPC补充到外周血中，从而导致外周血中EPC含量进一步减少，虽然部分动物实验已证实外源性EPC移植的治疗效果，但是否可通过EPC移植实现人类缺血性脑血管病的治疗有待进一步研究。④在动物实验中，移植骨髓源性EPC可增加血管动脉硬化斑块形成，同时也使斑块易于破裂，增加了斑块的易损性[36]。⑤移植的EPC在体内存活时间很短，尚有待提高，且缺氧条件本身可促进骨髓源性EPC凋亡。

EPC可能在缺血性脑血管病的治疗中发挥一定作用。它的治疗作用主要体现在促进缺血损伤后脑组织血管新生和神经发生两方面。经相关研究证实，移植外源性EPC、加强内源性EPC动员及应用EPC分泌因子的“无细胞”治疗等方式均可治疗缺血性脑血管病。此外，EPC对缺血性脑血管病的严重性及预后存在预测价值。尽管在目前的研究中，EPC在缺血性脑血管病患者的临床治疗中仍受到一定限制，但大量的研究已经证实了EPC的治疗潜力，值得在缺血性脑血管病的治疗中进一步探索。

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【点睛】本文对内皮祖细胞治疗缺血性脑血管病的作用机制，治疗策略，以及在临床应用中尚存在的问题展开阐述。