新型CDK抑制剂联合ZD55-MnSOD溶瘤腺病毒体外抑制人结肠癌细胞增殖的研究

韩剑翠, 马步云, 吴程雨, 王毅刚, 王世兵,b

(浙江理工大学, a. 新元医学与生物技术研究所; b. 生命科学学院科研实验中心, 杭州 310018)

新型CDK抑制剂联合ZD55-MnSOD溶瘤腺病毒体外抑制人结肠癌细胞增殖的研究

韩剑翠a, 马步云a, 吴程雨a, 王毅刚a, 王世兵a,b

(浙江理工大学, a. 新元医学与生物技术研究所; b. 生命科学学院科研实验中心, 杭州 310018)

探究携带MnSOD的溶瘤腺病毒Ad-E1B55Kd-MnSOD(ZD55-MnSOD)联合小分子药物新型CDK抑制剂SNS-032对人结肠癌细胞株SW620、HCT116、HT-29生长的体外抑制效果,通过溶瘤病毒与药物联合,以期寻求较好的抗癌作用。实验采用MTT法检测5 MOI的ZD55-MnSOD与不同剂量的SNS-032(0、20、40、80、160 ng/mL)联合处理人结肠癌细胞株,发现病毒与药物联合处理有促进肿瘤细胞凋亡的作用。ZD55-MnSOD(5 MOI)与SNS-032(80 ng/mL)联合处理SW620、HT-29细胞,发现联合作用具有很大程度上的时间依赖性,Hoechst33342染色法和流式细胞仪检测细胞凋亡也显示ZD55-MnSOD与SNS-032联合处理组的细胞凋亡现象比二者单独使用均具有显著差异。该研究初步证实了ZD55-MnSOD与SNS-032联合具有互补作用,能有效地在体外抑制人结肠癌细胞的增殖。

溶瘤腺病毒; SNS-032; 结肠癌; 抗癌作用

0 引 言

ZD55病毒是肿瘤特异性增殖型病毒,ZD55溶瘤病毒它缺少在正常细胞中复制所必需的基因,因此它可以特异性地在肿瘤细胞中复制,然而在正常细胞中却不复制,由此达到抑制肿瘤细胞增殖的作用。目前,关于溶瘤腺病毒的研究迅速发展,可以通过改造启动子或者删除非必须基因来达到较好的靶向效果,也有人用溶瘤腺病毒作为载体携带抗体或RNA治疗癌症[1-2]。中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所的刘新垣院士在2001年首次正式提出了癌症的靶向基因-病毒治疗(Targeting Gene-Virotherapy)的概念[3-4],基于此概念,本实验采用ZD55溶瘤腺病毒,因为它能够满足肿瘤基因-病毒治疗的两个需要元素:具有靶向性和有可插入外源基因的位点,这为我们进一步开展肿瘤的靶向基因-病毒治疗提供了一个理想的平台。本实验采用的是锰超氧化物歧化酶基因(manganese superoxide dismutase, MnSOD),它是一种新型肿瘤抑制基因[5],属于超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)家族。SOD家族是将超氧阴离子转化为过氧化氢的抗氧化酶,可以保护细胞免受过氧化氢损伤,是机体内的一系列抗氧化防御系统。MnSOD它作为细胞内重要的抗氧化酶,不但可以清除细胞内的活性氧(reactive oxygen species, ROS),从而减少失衡或高浓度的ROS的产生对细胞产生一系列的损伤,对蛋白和核酸的损伤所导致的细胞的变异包括细胞的癌变和细胞的死亡,进而防止细胞癌变[6]。实验证实,MnSOD基因具有防止正常细胞转化为肿瘤细胞的功能,并且可以抑制肿瘤细胞的快速生长和促使肿瘤细胞的凋亡,MnSOD基因在治疗人结肠癌方面具有很好的抗肿瘤效果[7-10]。然而,ZD55-MnSOD又有一定的局限性,因为要达到一定的治疗效果就需要增加病毒的使用剂量,但是由于腺病毒它本身会对细胞产生一定的伤害,所以高的病毒剂量会增加治疗的风险。要实现使用很少的病毒剂量又要达到很好的治疗效果,笔者认为可否将病毒与新型小分子药物进行联合治疗。研究发现其与某些抗肿瘤药物的机制很不相同,二者有可能存在协同性,将二者进行联合作用有可能进一步有助于肿瘤方面的研究。

SNS-032(也称为BMS-387032)是一种新型CDK抑制剂,它可以有效地选择性抑制CDK2、CDK7、CDK9[11-17]。对于SNS-032的研究已有很多报道,它的抗肿瘤效果在多种细胞中都有很好的作用,如结肠癌[18]、乳腺癌[19]、肺癌[12]。该药已进入临床一期实验阶段[16,20],无论是作用于实体瘤还是恶性胶质瘤细胞,甚至是肿瘤干细胞都都显示出很好的抗肿瘤效果[21],并且与一般的抗肿瘤药物相比,其具有更高的选择性,并且作用于实体瘤时毒性很弱,较低的药物剂量便可达到很好的抗肿瘤效果[14,20,22]。然而此药物与病毒联合治疗的效果尚不清楚,本实验研究溶瘤腺病毒ZD55-MnSOD与小分子药物SNS-032联合抑制人结肠癌细胞的抗癌作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物及试剂

腺病毒ZD55-MnSOD由本实验室构建完成。SNS-032购自SELLECK公司。细胞培养用DMEM及胎牛血清购自GIBCO公司。

1.1.2 人结肠癌细胞株及培养

人结肠癌细胞株HCT116、HT-29、SW620均为本实验室保存。细胞培养在含10% FBS的DMEM培养基中,37℃,5% CO2条件下恒温培养,每2～3 d传代1次。

1.2 方法

1.2.1 MTT法检测细胞存活率

将对数期生长的肿瘤细胞按每孔5 000个细胞植入96孔培养板中培养,每孔加入培养液的体积为100 μL,待细胞贴壁后,加入相应的病毒与药物,体积为20 μL,37℃,5% CO2恒温培养箱中培养至指定的时间,每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT。37℃,5% CO2培养4 h后,每孔加入150 μL DMSO,剧烈震荡10 min,在酶标仪上测定490 nm波长处的吸光值。实验中设不加细胞的空白对照孔。按以下公式计算肿瘤细胞的存活率:

肿瘤细胞存活率=(处理组OD值—空白组OD值)/(对照组OD值—空白组OD值)×100%。

1.2.2 Western blot检测溶瘤腺病毒ZD55-MnSOD 目的基因的表达

将5×105个肿瘤细胞铺于6孔板,每孔加入培养液的体积为1.6 mL,待细胞贴壁后,按照要求分别加入5 MOI的病毒、终浓度为80 ng/mL的SNS-032及加入5 MOI的病毒联合80 ng/mL的SNS-032各400 μL,以不加病毒的细胞作为对照,在37℃,5%CO2恒温培养箱中培养48 h后,用4℃预冷的PBS洗板两次,每孔加入100 μL裂解液,冰上充分裂解15 min后,收入离心管,100℃变性10 min,12 000 r/min,5 min。将上清分装于-20℃备用,用时直接溶解上样。将定量蛋白以每孔加入10 μg总蛋白样加入SDS-PAGE电泳,电泳结束后按半干转膜法转膜(PVDF膜),5%的脱脂奶粉中封闭2 h,一抗孵育,按抗体说明书上的最佳稀释浓度稀释加一抗(1∶1 000稀释),室温下于摇床孵育2 h,TBST洗膜3次,每次10 min,加入稀释好的荧光二抗(1∶15 000稀释),室温下摇床孵育45～60 min,TBST洗膜3次,每次10 min,用LI-COR扫膜仪扫膜,红外激光成像系统对待测蛋白进行分析。

1.2.3 Hoechst33342染色检测细胞的凋亡

将对数期的肿瘤细胞按5 000个/孔植入96孔培养板,每孔加入培养液的体积为100 μL,在37℃,5%CO2恒温培养箱中培养,待细胞贴壁后,用不同浓度的药物处理HCT116细胞,36 h后,用PBS洗细胞两次,加入浓度为1 mg/mL的Hoechst33342体积为1 μL,使Hoechst33342的终浓度在0.5～10 μg/mL之间,继续在37℃,5% CO2恒温培养箱中孵育15 min,然后在荧光显微镜下观察细胞核的变化并拍照。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞的凋亡

接种5×105个肿瘤细胞铺于6孔板,每孔加入培养液的体积为1.6 mL,待细胞贴壁后,按照要求分别加入5 MOI的病毒、终浓度为80 ng/mL的SNS-032及加入5 MOI的病毒联合80 ng/mL的SNS-032各400 μL,以不加病毒的细胞作为对照,在37℃,5% CO2恒温培养箱中培养48 h后,用PBS洗细胞两次,收集细胞,参照AnnexinV/PI双染细胞凋亡检测试剂盒操作说明,于流式细胞仪上检测。

1.3 统计学分析

使用Excel 2003分析数据,用GraphPad5.0作图,结果采用t检验,NS表示差异不显著,P<0.05表示差异显著,用“*”表示,P<0.01表示差异极显著,用“**”表示。

2 结 果

2.1 单独使用SNS-032对结肠癌细胞的存活率的 影响

通过MTT法检测不同剂量的SNS-032对不同结肠癌细胞在不同时间的杀伤作用,结果如图1所示。图1显示SNS-032对人结肠癌细胞的抑制作用具有剂量依赖性和时间依赖性。较低剂量的SNS-032就可以达到很好的抑制肿瘤细胞增殖的作用;同时,可以看出不同的结肠癌细胞对药物的敏感度不同。如图1所示,在24 h时,药物剂量为160 ng/mL SNS-032对HCT116细胞和SW620细胞作用效果稍差于80 ng/mL的药物剂量,说明在短期内,细胞对较高的药物剂量具有一定的耐药性,因此,笔者进一步做了将病毒与不同的药物剂量联合处理不同的结肠癌细胞。

2.2 不同剂量的SNS-032与5 MOI的ZD55-MnSOD 病毒联合作用于三种不同的结肠癌细胞HCT116、 HT-29、SW620的抗癌效果

以不同剂量的SNS-032与5MOI的溶瘤腺病毒联合分别感染HCT116、HT-29、SW620细胞,在72 h后,检测其对人结肠癌细胞的存活率的影响,结果如图2所示。图2可见，SNS-032与ZD55-MnSOD联合作用时,对三种结肠癌细胞的增殖均有明显的抑制作用,并且随着SNS-032药物浓度增加,对人结肠癌细胞的抗癌效果越好,在剂量为160 ng/mL的SNS-032与ZD55-MnSOD联合作用于HT-29时,HT-29细胞存活率大约只有10%左右。

2.3 用5MOI的溶瘤腺病毒与80 ng/mL的SNS- 032药物联合,在不同时间对HT-29和SW620 细胞的抗癌作用

用5MOI的溶瘤腺病毒与80 ng/mL的SNS-032药物处理HT-29细胞和SW620细胞24、48、72 h和96 h后,MTT检测不同时间联合处理对肿瘤细胞增殖的影响,结果如图3。SNS-032与ZD55-MnSOD联合作用HT-29细胞96 h时,对肿瘤细胞的杀伤作用明显强于单独使用病毒或药物。SNS-032

与ZD55-MnSOD联合作用于SW620细胞96 h时,联合作用的效果明显高于单独使用药物或病毒,并且对HT-29和SW620细胞均呈现出随着时间的增加,作用效果越明显,说明病毒与药物联合具有明显的时间依赖性。

2.4 Western blot检测溶瘤腺病毒ZD55-MnSOD 目的基因的表达

ZD55-MnSOD,SNS-032,ZD55-MnSOD与SNS-032联合处理HCT116细胞,剂量分别为5 MOI、80 ng/mL以及5 MOI+80 ng/mL,设立加等量的PBS作为对照组,在37℃,5% CO2恒温培养箱中培养48 h后,Western blot检测目的基因MnSOD的表达，结果如图4。图4显示，GAPDH为内参蛋白,单独使用ZD55-MnSOD处理HCT116细胞表达的MnSOD比对照组和单独使用SNS-032的量都明显提高,并且ZD55-MnSOD与SNS-032联合处理的表达量比任何一种也都明显提高,说明ZD55-MnSOD与SNS-032联合可以增加MnSOD的表达量。

2.5 Hoechst33342染色观察细胞凋亡

通过染色,检测病毒及药物处理后细胞核的形态学变化及凋亡情况。如图5所示:PBS处理的对照孔细胞没有发生形态学的变化,细胞密度大,并且均匀铺散开,基本没有细胞凋亡;然而病毒与药物处理组的细胞生长受到明显的抑制并且出现明显的细胞凋亡状态,发生凋亡的的细胞其细胞核染色质会发生明显凝集、固缩、并伴有凋亡小体出现。并且,随着药物剂量的升高,凋亡增多。

2.6 流式细胞术检测细胞凋亡

ZD55-MnSOD与不同剂量的SNS-032(0、20、40、80、160 ng/mL)联合处理HCT116细胞,设立加等量PBS的对照组,在37℃,5% CO2恒温培养箱中培养48 h后,用不含EDTA的胰酶收集细胞,AnnexinV/PI双染参见流式试剂盒检测细胞凋亡(图6)。图6(a)显示,病毒与不同浓度的药物联合,所用药物浓度越高,早期和晚期凋亡都有增加,随着药物剂量的提高,早期和晚期凋亡现象越明显。在药物剂量为160 ng/mL时,早晚期凋亡共达到12%左右。图6(b)为统计学分析对照组与加药组出现明显差异。

3 讨 论

随着科技的不断发展,治疗癌症的药物大批涌现,但药物的副作用及其抗癌效果都还很难预测,找到一种科学合理的治疗方法势在必行。本实验采用ZD55-MnSOD与不同剂量的SNS-032联合作用于人结肠癌细胞株,实验证明二者的联合作用比单独使用病毒或单独使用药物效果均要显著,可以有效地抑制肿瘤细胞的增殖并促进肿瘤细胞的凋亡。MTT结果表明,单独使用药物处理人结肠癌细胞时,在一定范围内随着药物剂量的增加,药物对肿瘤细胞的增殖有抑制作用,但较高的药物剂量时,会降低对肿瘤细胞的抑制能力。然而,用病毒与药物联合处理人结肠癌细胞,随着药物剂量的增加,对肿瘤细胞的杀伤能力越强,并且,二者的联合具有时间依赖性。Hoechst33342染色观察发现,单独SNS-032或ZD55-MnSOD处理的细胞只有很少凋亡现象出现。而药物联合组有明显的凋亡小体出现,并且有大量细胞发生凋亡。应用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡,验证发现与MTT结果符合,发现二者联合作用时,能有效地促进人结肠癌细胞发生凋亡,并且凋亡多发生于凋亡早期阶段。在本实验中,为了降低过高的病毒剂量可能会增加治疗的风险,采用较低的病毒剂量与药物联合,这样既能降低各自的剂量,又能达到很高的抗肿瘤效果。然而,ZD55-MnSOD联合SNS-032时,最佳协同作用的剂量以及具体的引起它们联合作用的机制仍有待进一步研究。并且笔者所用的SNS-032并不是具有广谱性的抗癌药物,因为有研究表明它对某些细胞具有一定的耐药性,由于具有耐药性,有可能需加大药物的使用剂量,因此,SNS-032对其他肿瘤细胞的治疗效果还有待进一步验证。本实验为以后的体内实验打下理论基础,对临床实验也具有一定的参考价值。

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(责任编辑： 许惠儿)

In-Vitro Inhibitory Effect of Oncolytic Adenovirus ZD55-MnSODCombined with New CDK Inhibitor on Human Colon Cancer Cells

HAN Jian-cuia, MA Bu-yuna, WU Cheng-yua, WANG Yi-ganga, WANG Shi-binga,b

(a. Xinyuan Institute of Medicine and Biotechnology, b. Research Centre, School of Life Science,Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)

The research is to develop in-vitro inhibitory effect of MnSOD carried oncolytic adenovirus Ad-E1B55Kd-MnSOD (ZD55-MnSOD) combiend with small molecular drug novel CDK inhibitor SNS-032 on colon cancer cell lines such as SW620, HCT116 and HT-29. Oncolytic virus and drugs were combined to seek good antitumor effects. In this experiment, MTT was used to detect the application effect of 5MOI ZD55-MnSOD combined with different dosage of SNS-032 (0, 20, 40, 80, 160 ng/mL) on human colon cell line. The authors found that the combination of oncolytic virus and drug could promot tumor cell apoptosis; and also found that treatment of SW620 and HT-29 with combined ZD55-MnSOD (5 MOI) and SNS-032 (80 ng/mL) had great time dependence. Hoechst33342 staining method and flow cytometry were used to detect apoptosis. The results aslo show that the apoptosis phenomenon in the group of combined use of ZD55-MnSOD with SNS-032 has better effects than separate use of oncolytic virus or drug alone. This research preliminarily proves ZD55-MnSOD (5 MOI) and SNS-032 have supplementary effect and can effectively inhibit the growth of colon cancer cells in vitro.

oncolytic adenovirus; SNS-032; colon cancer; antitumor effect

1673- 3851 (2015) 05- 0688- 06

2014-09-26

国家自然科学基金项目(81272687);浙江省自然科学基金项目(LY13H080005,LZ13H160004);浙江省科技计划项目(2014C37101);浙江理工大学科研启动基金项目(1204807-Y)

韩剑翠(1988-),女,黑龙江林口人,硕士研究生,主要从事肿瘤的靶向基因-病毒治疗方面的研究。

王世兵,E-mail:wsb@zstu.edu.cn

Q789

A