基于OptiPrep的循环肿瘤细胞富集体系研究

郑罗凝, 徐增辉, 王 真, 钱其军,

(1. 浙江理工大学生命科学学院, 杭州 310018; 2. 第二军医大学东方肝胆外科医院, 上海 200438)

基于OptiPrep的循环肿瘤细胞富集体系研究

郑罗凝1, 徐增辉2, 王 真2, 钱其军1,2

(1. 浙江理工大学生命科学学院, 杭州 310018; 2. 第二军医大学东方肝胆外科医院, 上海 200438)

建立一种简易高效的外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cell, CTC)富集方法。配比不同浓度的OptiPrep溶液梯度离心分离外周血各细胞成分,比较OptiPrep液与现行Ficoll液富集肿瘤细胞的效率、回收率、活性率。以此系统富集肿瘤患者血样中的CTC,结合免疫磁珠筛选、染色体原位荧光杂交和表面抗原免疫荧光技术精确鉴定CTC细胞。结果显示OptiPrep液以1.079 g/mL的密度浓度在1 900 r/min离心20 min为最优分离条件。32例临床肿瘤患者血样的CTC检测实验中,均发现有循环肿瘤细胞的存在。结果表明基于OptiPrep液结合免疫磁珠筛选能有效富集外周血循环肿瘤细胞,为实验室常规开展CTC的计数、培养等研究奠定基础。

OptiPrep分离介质; 密度梯度离心法; 循环肿瘤细胞; 免疫磁珠

0 引 言

循环肿瘤细胞(circulating tumor cell, CTC)从原发肿瘤病灶脱落下来,通过血液循环系统传播到远端器官,在新的环境中生长并形成转移病灶。目前认为,肿瘤复发的关键在于CTC潜在的侵袭能力[1]。有报道显示CTC检测及其预后相关性对于评估临床治疗效果十分有意义。除了转移性癌症患者的预后价值以外,CTC对于早期癌症的预测价值也很有吸引力[2]。因而CTC成为研究癌症治疗和转移潜在机制的重要生物标志物。然而,外周血中能检测到的CTC个数极少,每7.5 mL血液中可能仅含几个[3],从而对血液中富集CTC这一技术提出了挑战。

当前的富集方法主要是基于细胞的物理特性(大小和密度),包括密度梯度离心分离,微孔过滤,ISET(上皮肿瘤细胞大小分选)等[4-5]。已经获得美国FDA批准的CellSearch用作晚期乳腺癌、结肠直肠癌以及前列腺癌的预后[6]。它是基于细胞表面特异生物标记物,从而分离血液中的CTC,以此为技术的方法必须预先了解待测癌细胞的特异抗原,因而不能通用于所有癌症,容易漏检或错检。另外,此技术试验成本高(约5000元/例),设备费用更是高昂,一般实验室难以承受。为了克服这种局限性,考虑去除血液中的红细胞、血浆和大量白细胞,留存CTC以达到富集的目的。

密度梯度离心是根据细胞密度分选多种细胞,可有效去除红细胞和血浆等。分离的关键因素是高质量的分离介质。目前应用于细胞分离的介质主要有Ficoll、Percol、Nycodenz和Onco-Quick[7],Percol的价格虽然较低,但是很难聚集细胞形成清晰的条带,Nycodenz为固体,配制复杂且不易控制浓度。本研究为采用OptiPrep法分离外周血CTC。OptiPrep是一种60%的Iodixanol水溶液,Iodixanol则是非离子等渗分子[8]。相比而言,OptiPrep液体配制简便,对细胞的损伤较小,富集条带明显,细胞纯度高。已有研究发现OptiPrep主要应用于鼠原代肝星状细胞的分离纯化,且使用OptiPrep纯化胰岛细胞可能有助于增加胰岛移植的成功[9]。本文旨在探讨OptiPrep液富集CTC的可行性,建立一种合理、便捷的分离方法,为实验室进行常规的CTC检测和分析奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 血样:取长海医院血库健康人外周血10 mL全血30份用于试验;实体肿瘤患者血样由东方肝胆外科医院生物治疗科提供,入组患者多为中晚期肿瘤,采血前多接受过手术、放疗、化疗等相关治疗,均已获得患者知情同意。

1.1.2 人肿瘤细胞株:肝癌细胞QGY-7701、SMMC-7721、Huh-7,卵巢癌细胞HO-8910,肺癌细胞A549均来自东方肝胆外科医院基因与病毒治疗实验室。

1.1.3 试剂与仪器:Hepes(上海博光生物科技有限公司),OptiPrep(Sigma公司),Ficoll(GE Healthcare公司),Viacount(密理博中国有限公司),CD45-FITC(美国BD公司),CFSE(eBioscience公司)。低速台式大容量离心机(上海安亭科学仪器厂),Guava流式细胞仪(密理博中国有限公司),光学显微镜(上海悌可光电科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 OptiPrep离心分离外周血

最佳离心条件的确定:离心机使用时选择慢制动状态,避免短时加速使各密度梯度细胞发生混杂。将外周血与生理盐水1∶1混合稀释,沿壁缓慢加至1.079 g/mL细胞分离液液面上。分别以不同离心转速分离,记录不同时间红细胞沉淀体积。

各层细胞CD45标记流式检测:密度梯度离心后分别吸取上清液、白膜层和分离液,各取200 uL细胞悬液,加CD45-FITC荧光单抗,轻轻混匀,4℃避光孵育15～30 min,重悬细胞后上机检测CD45+阳性细胞比例。

1.2.2 筛选OptiPrep分离液最佳密度浓度

3种密度浓度的OptiPrep分离液配制:室温条件下,将60% OptiPrep原液稀释至40%工作液,与缓冲液按比例混合,充分混匀后得到3种密度浓度的分离液:1.074、1.079、1.085 g/mL。4℃避光保存。

Viacount试剂盒检测3种密度浓度的OptiPrep液分离外周血单核细胞的细胞数和细胞活力。

1.2.3 OptiPrep离心分离肿瘤细胞

CFSE荧光标记肿瘤细胞:用PBS等合适的缓冲液调整细胞浓度少于107个/mL;加入1 uL浓度为5 uM的CFSE工作液,轻轻吹打混匀;37℃避光孵育15 min;加入4～5倍体积的完全培养基,冰上孵育5 min;离心后去上清,加入1 mL PBS溶液,再离心后去上清,重复清洗3遍。流式检测肿瘤细胞CFSE荧光表达。

外周血肿瘤细胞的分离:将带有荧光标记的肿瘤细胞株QGY-7701加入外周血混匀,以此模拟CTC,密度梯度离心后分别吸取白膜层和分离液,各取200 uL细胞悬液上机检测CFSE阳性细胞比例。

1.2.4 比较OptiPrep液与Ficoll液的富集效率

将带有荧光标记的肿瘤细胞QGY-7701、SMMC-7721、Huh-7、HO-8910、A549等量加入外周血混匀(1×105个/mL),分别在两种分离液中密度梯度离心后吸取白膜层,流式检测富集细胞中CFSE阳性细胞的比例并进行比较。

1.2.5 比较OptiPrep液与Ficoll液的回收效率

由于实际患者血液中CTC数量极少,为检验建立的方法是否能够富集到极少量的肿瘤细胞,逐个挑取了50个左右的单细胞加入5 mL外周血中,密度梯度离心分离进行回收率实验。单个肿瘤细胞的挑选采用CellEctor Plus细胞分选系统。

极少量肿瘤细胞的富集回收效率:将带有荧光标记的肿瘤细胞QGY-7701适量加入5 mL外周血混匀(以50个为宜),分别在两种分离液中密度梯度离心后吸取白膜层,固定细胞后将细胞悬液涂于载玻片上,避光晾干后盖上盖玻片,荧光显微镜下观察带有荧光的细胞即为回收得到的肿瘤细胞,计数并记录结果。

1.2.6 肿瘤患者循环肿瘤细胞的检测试验

患者7.5 mL外周血进行OptiPrep介质分离富集后,结合免疫磁珠纯化,将获得的细胞固定后,进行原位荧光杂交和免疫细胞化学染色以鉴别循环肿瘤细胞。

1.3 统计学分析

2 结果与分析

2.1 OptiPrep离心分离外周血

2.1.1 细胞分层效果的研究

OptiPrep液离心后细胞分层效果明显,利用不同密度细胞沉降系数的不同能够有效地富集单核细胞形成云雾状的白膜层,清晰可见于分离液上层(图1b)。

OptiPrep液离心条件的优选:外周血密度梯度分离后,在不同时间观察红细胞沉淀体积随着时间的增加而增长,分离液由浑浊逐渐变清,并且比较20 min和30 min没有显著差异。同时选取不同离心转速重复实验,由表1可见1 600、1 800 r/min离心力较弱,液体分层不明显,红细胞沉降体积较少,而1 900 r/min和2 100 r/min的分离效果相似,为保护细胞活性因而选择1 900 r/min离心20 min为最优条件进行后续分离实验(表1)。

2.1.2 流式检测各层单核细胞

流式结果显示,白膜层中大部分细胞表达CD45+,分离液中仅部分细胞表达CD45+,而上清液中的细胞量很少且均为CD45-细胞(图2)。

2.1.3 筛选OptiPrep最优密度浓度

从表2可知,外周血中单核细胞数在OptiPrep液密度浓度1.085 g/mL时最多,并随分离液密度浓度的减少而呈现下降趋势;同时,3种密度浓度的OptiPrep液获得的细胞活性率均在90%以上,活力较高。比较分析1.079 g/mL的细胞数量和细胞活性率比1.074 g/mL的有显著差异(P<0.05),对比1.085 g/mL无显著差异;细胞活性率1.079 g/mL的最高,并且所有报道中细胞分离液的密度为1.077 g/mL,因而选取1.079 g/mL的OptiPrep液进行后续实验。

2.2 OptiPrep离心分离肿瘤细胞

选取肝癌细胞株QGY-7701,CFSE标记肿瘤细胞后,流式检测荧光信号表达为100%(图3a)。

将带有荧光的肝癌细胞QGY-7701加入外周血中,模拟外周血分离循环肿瘤细胞,流式检测CFSE荧光发现,在白膜层中部分细胞表达CFSE,分离液中细胞不表达CFSE(图3b、c)。

2.3 比较OptiPrep液与Ficoll液的富集效率

2.3.1 不同肿瘤细胞株的比较

将CFSE荧光标记的肿瘤细胞QGY-7701、SMMC-7721、Huh-7、HO-8910、A549流式检测(见图4),完全阳性表达的细胞以1×105个/mL加入外周血混匀后分离获取细胞富集层。流式细胞术检测QGY-7701-CFSE阳性细胞百分比,在OptiPrep液与Ficoll液中分别为4.67%和2.89%,OptiPrep液富集肿瘤细胞的效率高于Ficoll液。其他几种肿瘤细胞Huh7、SMMC-7721、HO-8910和A549在OptiPrep液中CFSE的阳性细胞百分比为2.07%、3.34%、3.70%、3.50%,均高于Ficoll液中CFSE的阳性细胞百分比1.38%、1.89%、2.52%、2.91%,两组间差异均有统计学意义。

2.3.2 比较OptiPrep液与Ficoll液的回收效率

单个肿瘤细胞的挑选:由于CTC的稀有性,利用少量肿瘤细胞混入血液模拟外周血循环肿瘤细胞。

借助光学立体显微镜直接观察到目的细胞,通过操作毛细玻璃管吸取单个肿瘤细胞(图5)。

比较两种分离介质的肿瘤细胞回收率结果(表3):5次OptiPrep的回收率平均值为84.6%,比Ficoll的81.9%略高(P=0.086),表明OptiPrep分离红细胞、富集肿瘤细胞的效果与商品化的Ficoll试剂有较好的一致性。

2.4 患者循环肿瘤细胞的检测

用OptiPrep法对32例肿瘤患者外周血循环肿瘤细胞进行富集,再用抗CD45免疫磁珠进一步去除大量的白细胞,最后通过免疫荧光染色和荧光原位杂交技术对CTC进行鉴定和计数。细胞表型为DAPI+CD45-,并且染色体异常或CK18+的即定义为循环肿瘤细胞。32例患者均检测到有循环肿瘤细胞,CK18表达阴性的有25例,其中14例肝癌相关的患者均无法检测到CK18表达(表4)。

肿瘤细胞具有异质性,不同肿瘤以及同一种肿瘤、甚至是同一患者的不同发展阶段,其肿瘤细胞表面抗原均会发生变化[10]。本研究联合了肿瘤细胞表面抗原的免疫荧光染色和染色体的原位荧光杂交技术检测CTC,从表面标记和染色体异常双重角度鉴定CTC,相比CellSearch系统单一的表面抗原免疫荧光鉴定方法更具优势。实际检验结果也表明,肝癌中CK18表达很少或不表达,因而本研究采用的双重鉴定法更能有效预防对CTC的漏检、错检(图6)。

3 讨 论

循环肿瘤细胞(CTC)可作为一种癌症血源性转移的生物标记物。现有充分证据显示CTC的检测与癌症的预后相关,在临床上通过监测CTC评估治疗效果,以减少疾病的复发和改善病人的管理,同时对于早期癌症的发现也有意义[11]。但是,CTC在血液中的含量浓度非常低,数百万的血液细胞中可能仅有一个肿瘤细胞,而目前的技术对检测CTC十分困难,因而富集稀有CTC细胞并最大程度地去除血液中其他成分细胞是研究CTC的关键。目前最为常用的CTC富集方法是经由FDA批准上市的CellSearch系统,它利用上皮细胞特异性抗原EpCAM阳性筛查CTC,但事实上这一标志物的表达并不稳定,多数恶性肿瘤会发生上皮-间质转变(epithelial-mesenchymal transition, EMT),甚至约30%的上皮源性肿瘤不表达EpCAM,因而CellSearch方法限定CTC为EpCAM阳性细胞则可能漏检上皮间质化的肿瘤细胞。密度梯度离心结合免疫磁珠法能很好地避免这一缺陷,而其中分离介质的选择是密度梯度离心法的关键环节。

比较几种常用的血液分离介质:Percol是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒,价格较低,但很难聚集细胞形成清晰的条带;Nycodenz为固体,溶解度小,配制复杂且不易控制浓度;Onco-Quick增加了一层滤膜,可避免全血与分离液的混合,但其敏感度低,易造成肿瘤细胞的丢失。选择OptiPrep液作分离介质是由其为无菌液体,易于稀释为各种密度浓度,低渗透压和不穿过生物膜等分子特性决定的。实验结果显示,OptiPrep液分离外周血能有效形成云雾状的单核细胞层,清晰可见于分离液上层。离心后各分层细胞的流式检测表明,白膜层细胞中CD45标记的白细胞和CFSE标记的QGY-7701肿瘤细胞阳性均较高,而分离液和上清中两种细胞的阳性率很低甚至为阴性,上清中的细胞量也不多,说明需要富集的单核细胞主要聚集于白膜层中。

多数文献报道中,外周血分离介质的密度浓度一般为1.077 g/mL。本研究中涉及的3种密度浓度OptiPrep液中,3种密度浓度的OptiPrep液获得的细胞活性率均在90%以上,活力较高,有助于后期获取CTC并进行培养研究。比较分析1.079 g/mL的细胞数量和细胞活性率比1.074 g/mL的有显著差异(P<0.05),对比1.085 g/mL无显著差异;细胞活性率1.079 g/mL的最高,并且所有报道中细胞分离液的密度为1.077 g/mL,因而选取1.079 g/mL的OptiPrep液作为最佳密度浓度分离外周血CTC。

由于CTC的稀有性,便于更好地收集CTC,使后期的检测和鉴定实验相对简单,需要进一步检测富集细胞中CTC的纯度。通过3种肝癌细胞株和肺癌细胞株以及卵巢癌细胞株混入外周血模拟循环肿瘤细胞,比较OptiPrep液和Ficoll分离液的肿瘤细胞回收实验,研究发现几种肿瘤细胞在OptiPrep液中的富集效率均高于Ficoll液。另外,为了更真实的验证OptiPrep液富集CTC的效率并进行回收率的计算,本研究中用毛细微观进行单细胞挑取50个左右的肿瘤细胞,混合入血后进行回收率的研究。结果表明OptiPrep分离红细胞、富集肿瘤细胞的效果较好。

综上所述,本研究采用OptiPrep液作为分离外周血中循环肿瘤细胞的分离介质,其液体具有配制方便稳定,分层清晰易于获取细胞,渗透压低对细胞损伤较小,富集的CTC纯度高等优点,建立了一种简易高效的CTC富集体系。在此基础上,结合免疫磁珠筛选、染色体原位杂交和表面抗原免疫荧光技术,建立了高效精确的CTC鉴定体系,为进一步研究CTC甚至获取单个CTC进行分子鉴定奠定了基础。

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(责任编辑： 许惠儿)

Study on OptiPrep-based Enrichment System of Circulating Tumor Cell

ZHENG Luo-ning1, XU Zeng-hui2, WANG Zhen2, QIAN Qi-jun1,2

(1. School of Life Science, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China;2. Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, the Second Military Medical University, Shanghai 200438, China)

This study aimed to establish a simple and efficient enriching method of CTC (circulating tumor cell, CTC) in the peripheral blood. OptiPrep solutions with different concentration was prepared to separate different types of cells in peripheral blood, and the efficiency of enrichment, recovery, and cell viability of OptiPrep solution and Ficoll solution were compared. This system was used to enrich CTC in blood samples of cancer patients. CTC cells were identified in combination of immunomagnetic beads, chromosome fluorescence in situ hybridization and surface antigen immunofluorescence technique. The results show that the optimal separation condition is as follows: OptiPrep density 1.079 g/mL; the centrifugation speed and time 1 900 r/min, 20 min. During CTC examination of blood samples of 32 enrolled cancer patients, it is found that there exist circulating tumor cells. This study demonstrats that OptiPrep-based enrichment system combined with immunomagnetic beads could effectively capture circulating tumor cells in peripheral blood, which flays a foundation for CTC count, culture and other researches in laboratory.

OptiPrep separation medium; density gradient centrifugation; circulating tumor cells; immunomagnetic beads

1673- 3851 (2015) 05- 0699- 07

2014-11-24

国家自然科学基金项目(81071850,81301307)

郑罗凝(1986-),女,浙江台州人,硕士研究生,主要从事肿瘤基因治疗方面的研究。

钱其军,E-mail:qianqj@163.com

R73-37

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