黄酮类化合物与阿霉素联用对乳腺癌细胞MCF7凋亡的影响

吴登伟, 王毅刚, 郑婷婷, 郑旭升, 周秀梅, 许传莲

(浙江理工大学生命科学学院, 杭州 310018)

黄酮类化合物与阿霉素联用对乳腺癌细胞MCF7凋亡的影响

吴登伟, 王毅刚, 郑婷婷, 郑旭升, 周秀梅, 许传莲

(浙江理工大学生命科学学院, 杭州 310018)

为了考察6种不同结构黄酮类化合物(5-OH-3′-OCH3黄酮,7-OH-3′-OCH3黄酮,7-OH-2′-OCH3黄酮,3,5,7,4′-4OH黄酮,5,7,3′,4′-4OH黄酮,Neodiosmin)对乳腺癌细胞MCF7的药物敏感性,综合运用MTT法,Hoechst 33342染色法以及流式细胞术评价黄酮类化合物与阿霉素联用对MCF7的抑制效果。结果表明,部分黄酮类化合物细胞毒性较低,其中5-OH-3′-OCH3黄酮,7-OH-3′-OCH3黄酮,3,5,7,4′-4OH黄酮能明显增强阿霉素对MCF7细胞的抑制作用。同时发现黄酮类化合物与阿霉素联用在MFC7细胞上所表现出来的协同作用可能与黄酮类化合物A环上5位与7位的羟基取代相关。

黄酮类化合物; 阿霉素; 乳腺癌细胞MCF7; 联合用药; 凋亡

0 引 言

黄酮类化合物广泛存在于蔬菜水果等植物中,是一类天然多酚化合物,目前已被鉴定的黄酮化合物超过9000种,并且不断有新的结构被发现[1]。黄酮类化合物毒性小,分布广泛,药理活性丰富,被证明具有抗氧化[2]、抗炎[3]、抗菌[4]、抗病毒[5]等作用。近年来研究发现,黄酮类化合物具有良好的体内外抗肿瘤活性[6-7],可以同化疗药物联合使用,增加药物的敏感性,达到逆转肿瘤多药耐药性的效果。例如,白血病耐药细胞HL-60/ADM耐药株的体外实验发现黄酮类化合物槲皮素能明显提高化疗药物的敏感性[1]。而目前对于黄酮类化合物增强化疗药物对乳腺癌细胞MCF7抑制作用的研究相对缺乏,本研究主要利用MTT比色法检测黄酮类化合物增强阿霉素对乳腺癌细胞MCF7的抑制效果,并利用hoechst33342染色法及流式细胞术分析黄酮类化合物与阿霉素联合作用对乳腺癌细胞MCF7细胞凋亡的影响,考察乳腺癌细胞MCF7对治疗药物阿霉素的敏感性,为逆转乳腺癌耐药性、增强化学药物治疗效果提供新的思路和实验依据。

1 实 验

1.1 实验材料与仪器

CO2恒温培养箱(德国HERAEUS公司);超净工作台(美国NUAIRE公司);DK-8D型恒温水槽(上海一恒科技有限公司);超低温冰箱(美国NUAIRE公司);酶标仪(瑞士TECAN公司);流式细胞仪(美国BD公司);荧光倒置显微镜(日本OLYMPUS公司);液氮罐(英国ICI公司);高速冷冻离心机(日本HITACHI公司)。

MCF7细胞购自中科院上海细胞库;5-OH-3′-OCH3黄酮、7-OH-3′-OCH3黄酮、7-OH-2′-OCH3黄酮、Neodiosmin(新地奥明)购自美国SIGAMA公司;3,5,7,4′-4OH黄酮、5,7,3′,4′-4OH黄酮购自中国药品生物制品检定所;MEM培养基,胎牛血清(FBS)购自美国GIBCOBRL公司;胰酶,四甲基偶氮唑蓝(MTT),阿霉素(Doxorubicin)购自美国SIGAMA公司;二甲基亚砜(DMSO)购自杭州屹达化工有限公司;Hoechst33342购自上海碧云天生物技术研究所;Annexin V-ITC细胞凋亡检测试剂盒购自上海凯基生物技术发展有限公司。其他试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 MCF7细胞培养

MCF7细胞株用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的MEM培养基,于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养,传代时用0.25%的胰酶消化。

1.2.2 检测黄酮类化合物对MCF7细胞的抑制效果

1.2.3 检测黄酮类化合物作用前后阿霉素对MCF7 细胞的抑制效果

取对数期生长的MCF7细胞,以8×103个/孔接种于96孔板中,培养24 h,加入终浓度为40 μmol/L的黄酮类化合物,同时加入终浓度为0.03、0.1、0.3、1、3、10 μmol/L的阿霉素,继续培养48 h,加入MTT(5 mg/mL,10 μL/孔),继续避光孵育4 h,弃上清,每孔加入DMSO 150 μL,振荡10 min,用酶标仪测定570 nm波长处的吸光度A。计算阿霉素对MCF7细胞增殖的抑制率及IC50。

1.2.4 检测不同浓度黄酮类化合物对阿霉素抑制 MCF7效果的影响

取对数期生长的MCF7细胞,以8×103个/孔接种于96孔板中,培养24 h,加入终浓度为0.2 μmol/L的阿霉素,同时加入终浓度为10、20、40 μmol/L黄酮类化合物,继续培养48 h,加入MTT(5 mg/mL,10 μL/孔),继续避光孵育4 h,弃上清,每孔加入DMSO 150 μL,振荡10 min,用酶标仪测定570 nm波长处的吸光度A。计算不同浓度的黄酮化合物与阿霉素联用对MCF7细胞增殖的抑制率。

1.2.5 Hoechst染色法观察黄酮类化合物联合阿霉 素促MCF7细胞的凋亡情况

取对数期生长的MCF7细胞,以8×103个/孔接种于96孔板中,培养24 h,分别加入终浓度为0.2 μmol/L的阿霉素与终浓度为40 μmol/L的黄酮类化合物,培养24 h,加入终浓度为5 μg/mL的Hoechst 33342,染色30 min,在荧光显微镜下观察拍照。

1.2.6 流式细胞术检测黄酮类化合物联合阿霉素对 MCF7细胞凋亡影响

取对数期生长的MCF7细胞,以8×103个/孔接种于96孔板中,培养24 h,分别加入终浓度为0.2 μmol /L的阿霉素与终浓度为40 μmol /L的黄酮类化合物,继续培养48 h,收集细胞,4 000 r/min离心5 min,预冷PBS洗1遍,4 000 r/min离心5 min,弃上清,加入195 μL Annexin V-FITC结合液,轻轻重悬细胞,加入5 μL Annexin V-FITC,轻轻混匀,室温避光孵育10 min,4 000 r/min离心5 min弃上清,加入190 μL Annexin V-FITC结合液,轻轻重悬细胞,加入10 μL碘化丙啶染色液,轻轻混匀,冰浴避光,随即用流式细胞仪进行检测。

1.2.7 数据分析

2 结 果

2.1 黄酮类化合物对MCF7细胞的细胞抑制效果

黄酮类化合物基本结构如图1,6种黄酮化合物的结构见图2,同时它们(5-OH-3′-OCH3黄酮、7-OH-3′-OCH3黄酮、7-OH-2′-OCH3黄酮、3,5,7,4′-4OH黄酮、5,7,3′,4′-4OH黄酮、Neodiosmin)对MCF7细胞的IC50分别为209.51、344.39、126.14、191.27、147.07、241.80 μmol/L。图3显示6种黄酮类化合物对MCF7的抑制作用呈浓度依赖性增强,且在终浓度为40 μmol/L时整体上对细胞的抑制作用都较小,仅有5-OH-3′-OCH3黄酮与7-OH-2′-OCH3黄酮对细胞的抑制率高于30%。

2.2 黄酮类化合物对阿霉素化疗效果的影响

2.2.1 黄酮类化合物作用后阿霉素对MCF7细胞 的抑制率及IC50值

表1显示阿霉素对MCF7细胞的抑制作用呈剂量依赖性。当阿霉素浓度低于1 μmol/L时,与黄酮类化合物(40 μmol/L)联用对MCF7细胞增殖抑制率基本都明显(P>0.05)高于阿霉素单独作用;当阿霉素浓度为10 μmol/L时,只有与5-OH-3′-OCH3黄酮和3,5,7,4′-4OH黄酮联用的高于单独用药的抑制率。采用金氏公式分析两种药物联用的合并用药效应,结果表明5-OH-3′-OCH3黄酮、7-OH-3′-OCH3黄酮及3,5,7,4′-4OH黄酮与阿霉素联合作用Q值>1.15,表明与阿霉素联用具有协同作用;7-OH-2′-OCH3黄酮与阿霉素联合作用Q值在0.85～1.15之间，表明与阿霉素联用为相加作用;而Neodiosmin和5,7,3′,4′-4OH黄酮与阿霉素联合作用Q值<0.85,表明与阿霉素联用为拮抗作用。

注:与阿霉素单独作用组比较*P<0.05,**P<0.01.

2.2.2 黄酮类化合物作用后阿霉素化疗敏感性的影响

0.2 μmol/L阿霉素与10、20、40 μmol/L的黄酮类黄酮化合物联合作用MCF7细胞,如图4所示黄酮类化合物(3,5,7,4′-4OH黄酮,5-OH-3′-OCH3黄酮,7-OH-3′-OCH3黄酮,7-OH-2′-OCH3黄酮,5,7,3′,4′-4OH黄酮,Neodiosmin)对阿霉素的增敏作用随浓度增大而增强,说明黄酮类化合物能在一定程度上增强阿霉素的化疗敏感性。

2.2.3 Hoechst33342染色观察黄酮类化合物作用 后阿霉素对MCF7细胞凋亡的影响

0.2 μmol/L阿霉素与40 μmol/L黄酮类化合物联合作用MCF7细胞24 h,Hoechst33342染色30 min,结果如图5所示。图5可见，不加药物处理的对照组细胞基本没有发生凋亡现象,黄酮类化合物单独处理组也较少发生凋亡现象,阿霉素单独处理组则有凋亡小体(亮白色)出现,而阿霉素与5-OH-3′-OCH3黄酮,7-OH-3′-OCH3黄酮,3,5,7,4′-4OH黄酮联合作用MCF7细胞后凋亡小体较单独阿霉素处理组有明显增加,这表明上述几类黄酮类化合物有增强阿霉素促凋亡的功效。

2.2.4 流式细胞术检测黄酮类化合物联合阿霉素 对MCF7细胞凋亡影响

0.2 μmol/L阿霉素单独作用MCF7细胞凋亡及与40 μmol/L黄酮类化合物联合作用MCF7细胞48 h,结果如图6及图7显示,3,5,7,4′-4OH黄酮,5-OH-3′-OCH3黄酮,7-OH-3′-OCH3黄酮与阿霉素联合作用的凋亡率比阿霉素单独作用高,说明上述黄酮类化合物具有增强阿霉素诱导MCF7细胞凋亡的作用。

3 讨 论

乳腺癌是女性多发的恶性肿瘤之一,据统计世界范围内每年新增患者约200万人,死亡率呈逐年上升趋势[8]。近年来我国乳腺癌发病率以每年将近3%的幅度递增,对中国妇女的健康危害非常大[9]。

阿霉素作为临床常用的治疗乳腺癌药物,是一种细胞毒素类抗肿瘤药物。可抑制DNA及DNA依赖性的RNA的合成,抗瘤谱较广,对多种肿瘤均有作用,但是其容易引起呕吐恶心,脱发,高热,静脉炎等不良反应[10],其不良反应与用药剂量具有一定正相关性,这也在一定程度上限制其在临床上的使用。此外,单一使用阿霉素对乳腺癌患者进行化疗时,在中后期药效明显减弱,容易产生多药耐药性(multiple drug resistance, MDR)[11]。

鉴于阿霉素单独用药存在的缺点,发展联合用药成为阿霉素治疗乳腺癌的新方案。本实验将6种不同结构的黄酮类化合物分别与阿霉素联合作用于乳腺癌MCF7细胞,发现其中4种黄酮类化合物(5-OH-3′-OCH3黄酮,7-OH-3′-OCH3黄酮,3,5,7,4′-4OH黄酮,Neodiosmin)能显著增强低浓度阿霉素(0.01 μmol/L)对MCF7细胞的生长抑制效果(P<0.05),同时随黄酮类化合物浓度升高其增强效果也越明显。这说明上述几类黄酮类化合物能在保持阿霉素的化疗效果的基础上通过降低阿霉素用量来大大降低其副作用;另外一方面,黄酮类化合物的抗肿瘤活性研究一直是国内外的热点,例如,Lepley等[12]研究发现芹菜素能阻断人白血病细胞株HL-60、小鼠皮肤308细胞株的细胞周期于G2/M期,抑制细胞增殖;金雀异黄酮抑制乳腺癌细胞增殖,且同时抑制细胞的侵袭转移。Danyetta等[13]研究发现异黄酮对乳腺癌细胞增殖、雌激素受体亲和力及细胞凋亡有影响。

4 结 论

a) MTT实验表明7-OH-3′-OCH3黄酮,3,5,7,4′-4OH黄酮,5,7,3′,4′-4OH黄酮,Neodiosmin四个黄酮化合物本身对MCF7的抑制作用并不明显;进一步采用Hoechst 33342染色法以及流式细胞术考察阿霉素与黄酮类化合物联用发现5-OH-3′-OCH3黄酮,7-OH-3′-OCH3黄酮及3,5,7,4′-4OH黄酮与阿霉素联合能表现出很好的协同作用,明显增强阿霉素对MCF7细胞的抑制效果。

b) 初步的构效关系分析结果表明:黄酮类化合物上B环的取代基团数目越多,其在与阿霉素联用过程中表现出的拮抗效果就越强;A环和C环取代基团数目越多,在与阿霉素联用过程中表现出的协同效果就越强;A环5位的羟基取代在表现协同作用时较A环7位更强,而A,B及C环羟基取代越多,在一定程度上与阿霉素表现出的协同作用也越强,可能与其抗氧化性越强有一定关系。总之,黄酮类化合物与阿霉素联用,其羟基取代基的数目和位置对协同效果有显著的影响。

[1] 王 玮, 王 琳. 黄酮类化合物的研究进展[J]. 沈阳医学院学报, 2002, 4(2): 115-119.

[2] Cai Y, Sun M, Xing J, et al. Structure-radical scavenging activity relationships of phenolic compounds from traditional Chinese medicinal plants[J]. Life Sciences, 2006, 78: 2872-2888.

[3] Vasquez-Martinez Y, Ohri R V, Kenyon V, et al. Structure-activity relationship studies of flavonoids as potent inhibitors of human platelet 12-hLO, reticulocyte 15-hLO-1, and prostate epithelial 15-hLO-2[J]. Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2007, 15: 7408-7425.

[4] Brunskole M, Zorko K, Kerbler V, et al. Trihydroxynaphthalene reductase of Curvularia lunata-A target for flavonoid action[J]. Chemico-Biological Interactions, 2009, 178(1): 259-267.

[5] Liu A L, Wang H, Lee S, et al. Structure-activity relationship of flavonoids as influenza virus neuraminidase inhibitors and their in vitro anti-viral activities[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008, 16(15): 7141-7147.

[6] Plochmann K, Korte G, Koutsilieri E, et al. Structure-activity relationships of flavonoid-induced cytotoxicity on human leukemia cells[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2007, 460(1): 1-9.

[7] Cárdenas M, Marder M, Blank V C, et al. Antitumor activity of some natural flavonoids and synthetic derivatives on various human and murine cancer cell lines[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2006, 14(9): 2966-2971.

[8] 王希龙, 邱文秀, 贾中明, 等. 乳腺癌的诊断现状及最新进展[J]. 中国综合临床, 2012, 28(8): 787-788.

[9] 徐光炜, 胡永昇, 阚 秀. 中国10万妇女乳腺癌筛查初探[J]. 中国肿瘤, 2010, 19(9): 565-568.

[10] 开 贞, 玉 奎. 临床常用药物[M]. 济南: 山东科学技术出版社, 2005: 38.

[11] Ramachandran C, Melnick S J. Multidrug resistance in human tumors-molecular diagnosis and clinical significance[J]. Molecular Diagnosis, 1999, 4(2): 81-94.

[12] Lepley R A, Fitzpatrick F A. Inhibition of mitogen-activated protein kinase kinase blocks activation and redistribution of 5-lipoxygenase in HL-60 cells[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1996, 331(1): 141-144.

[13] Danyetta D D, Edgar S D, Serena L, et al. Evaluation of synthetic isoflavones on cell proliferation, estrogen receptor binding affinity, and apoptosis in human breast cancer cells[J]. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 2008, 108(1): 23-31.

(责任编辑： 许惠儿)

Inhibitory Effect of Doxorubicine Combined with Flavonoidson MCF7 Breast Cancer Cell

WU Deng-wei, WANG Yi-gang, ZHENG Ting-ting, ZHENG Xu-sheng, ZHOU Xiu-mei, XU Chuan-lian

(School of Life Science, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)

To investigate inhibition effects of Doxorubicine combined with 6 different kinds of flavonoids (5-OH-3′-OCH3flavonoid, 7-OH-3′-OCH3flavonoid, 7-OH-2′-OCH3flavonoid, 3, 5, 7, 4′-4OH flavonoid, 5, 7, 3′, 4′-4OH flavonoid, Neodiosmin) on MCF7 breast cancer cell, MTT assay, hoechst 33342 dyeing and flow cytometry were applied to assess inhibition effects of Doxorubicine combined with flavonoids. The result shows that some flavonoids have low cytotoxicity, such as 5-OH-3′-OCH3flavonoid, 7-OH-3′-OCH3flavonoid and 3, 5, 7, 4′-4OH flavonoid which can greatly enhance inhibition effect of Doxorubicine on MCF7 cell. And synergistic effect of Doxorubicine combined with flavonoids on MCF7 cell may be related to hydroxy replacement (5-OH, 7-OH) of flavonoids.

flavonoids; Doxorubicine; breast cancer cell MCF7; drug combination; apoptosis

1673- 3851 (2015) 05- 0706- 06

2014-12-12

国家自然科学基金项目(81272687)

吴登伟(1991-),男,浙江温州人,硕士研究生,主要从事药用植物生态方面的研究。

许传莲,E-mail:chuanlianxu@163.com

R961

A