自表达SIRPα-Fc融合蛋白对T细胞功能的影响

崔 磊, 黎 江, 刘 辉, 吴红平, 李林芳, 郝方元, 金华君, 钱其军,

(1. 浙江理工大学生命科学院新元医学与生物技术研究所, 杭州 310018; 2. 第二军医大学上海东方肝胆外科医院病毒基因治疗实验室, 上海 200438)

自表达SIRPα-Fc融合蛋白对T细胞功能的影响

崔 磊1, 黎 江2, 刘 辉2, 吴红平2, 李林芳2, 郝方元2, 金华君2, 钱其军1,2

(1. 浙江理工大学生命科学院新元医学与生物技术研究所, 杭州 310018; 2. 第二军医大学上海东方肝胆外科医院病毒基因治疗实验室, 上海 200438)

探讨携带SIRPα-Fc(SF)融合基因蛋白基因的重组腺病毒Ad35-SF感染T细胞后对T细胞功能的影响。腺病毒Ad35-SF感染Jurkat T细胞后,通过Western blotting及ELISA方法检测细胞上清中SF融合蛋白的大小与表达量;通过流式分析技术检测细胞表面CD47的封闭情况;通过CCK8方法检测细胞的增殖与对肿瘤细胞的杀伤作用。结果表明,Ad35-SF构建成功,其感染Jurkat T细胞后,能在其内表达并分泌产生大小约为48 kD的SF蛋白,细胞上清中SF的表达量可到达19.1 μg/mL。Ad35-SF(MOI=1)感染Jurkat细胞18 h后,细胞CD47阳性比例从97.06%下降到15.32%;当Ad35-SF感染复数增加至5,10时,CD47阳性比率进一步降低至2.94%和1.73%。相对于空病毒对照组,Ad35-SF感染Jurkat细胞48 h后其增殖效果提高了29%,对肝癌细胞株Hep 3B的杀伤作用提升25.6%(p<0.01)。结果表明构建的重组腺病毒Ad35-SF能有效感染Jurkat细胞并在其内表达分泌SF蛋白,封闭细胞表面的CD47,同时显著提高Jurkat细胞的增殖能力和对肝癌细胞的杀伤作用。

CD47; T细胞; 腺病毒; 肝癌

0 引 言

CD47是肿瘤细胞表面高表达的膜蛋白[1],其能与巨噬细胞表面的CD47的受体—信号调节蛋白α(Signal Regulatory Protein α,SIRP α)结合,释放“不吃我”信号,抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用,导致肿瘤细胞免疫逃逸[2-3]。研究表明,当CD47与SIRPα的结合被阻断后,可以增强巨噬细胞对肿瘤的吞噬作用[4-6]。另有研究表明,活化的T淋巴细胞中CD47高表达[7-8],其能与另一种CD47受体——血小板反应蛋白1(Thrombospondin-1,TSP1)结合,抑制T淋巴细胞的增殖与活化,进而影响T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用[9-12]。因此,封闭细胞表面的CD47将有助于维持巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬以及T淋巴细胞的增殖与活化。

在本研究中,笔者将来自于SIRPα突变株CV1(由Weiskopf等[13]发现)、具有高亲和力结合CD47的作用的肽段与人类IgG1的Fc段基因融合,组成SF融合基因嵌入到35型非增殖型腺病毒中。利用新构建的腺病毒Ad35-SF感染T淋巴细胞,原位表达并分泌SF蛋白从而封闭细胞表面的CD47。本实验选用易于被腺病毒感染的Jurkat细胞作为研究对象,探索封闭CD47的Jurkat细胞对肝癌细胞的杀伤影响,为病毒Ad35-SF感染CTL细胞以及CIK细胞后对肿瘤细胞杀伤影响的研究提供指导。

1 实 验

1.1 实验材料与仪器

用于鉴定病毒和SF基因的引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成(合成的引物序列如表1)。E.coliDH5α菌,腺病毒载体pPE3-F35,载体质粒pDC898,SIRPα-Fc(SF)基因模板质粒均由第二军医大学东方肝胆外科医院基因-病毒治疗实验室构建保存。Lipofectamine 2000转染试剂盒、细胞培养血清、培养液购于Gibco公司,人胚肾细胞HEK293、肝癌细胞Hep-3B由第二军医大学东方肝胆外科医院基因-病毒治疗实验室保存备用。羊抗人IgG、兔抗人IgG、鼠抗兔IgG-HRP、鼠抗人IgG-HRP均购于Abcam公司,流式细胞仪guava easycyte BHT购于MERCK公司,ChemiDocXRS购于伯乐生物公司,同型抗体鼠抗人IgG-FITC以及鼠抗人CD47-FITC抗体均购于BD公司。CCK8试剂盒购于同仁化学。

1.2 实验方法

1.2.1 病毒包装、扩增和鉴定

将pDC898和pCA19-SF通过SalI和EcoR I双酶切,pDC898酶切产物电泳回收5 262 bp的基因片段,pCA19-SF酶切产物电泳回收1 143 bp的基因片段。所得的大小片段产物进一步连接、转化,挑取阳性克隆,抽提质粒进行酶切鉴定,鉴定正确的质粒送北京六合华大基因有限公司测序。命名正确的质粒为pDC898-SF。随后将质粒pDC898-SF与腺病毒骨架质粒pPE3-F35利用Lipofectamine 2000共转染HEK293细胞,包装并获得4个Ad35-SF病毒株。应用Qiagen DNA Kit提取重组腺病毒DNA,对病毒基因组进行PCR鉴定,采用有限稀释法测定病毒滴度。

1.2.2 Western blotting法检测

Jurkat细胞采用1640+10%胎牛血清(FBS)培养液。0.25%胰酶消化细胞、传代,37℃、5% CO2条件下培养。使用重组病毒Ad35-SF分别以MOI=1、5、10感染5×105/孔的Jurkat细胞,饥饿感染2 h后,每孔补加2%的FBS和无血清的1640培养液至终体积为3 mL,感染48 h后收取上清。将收集到的上清加入蛋白上样缓冲液100℃煮10 min。冷却后以每孔10 μL的量上样,经聚丙烯酰胺电泳后转移到PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭2 h,一抗(兔抗人IgG)4℃孵育过夜,洗膜,二抗(鼠抗兔IgG-HRP)室温孵育45 min,洗膜。将ECL试剂作用于PVDF膜上,暗室反应5 min于ChemiDocXRS仪器上拍摄。

1.2.3 ELISA法检测

采用双抗夹心法:用包被液将羊抗人IgG抗体稀释到1.0 μg/mL,100 μL/孔包被酶标板,4℃过夜;PBST清洗5次拍干,每孔加入100 μL封闭液(2% BSA),37℃孵育1 h;PBST清洗5次拍干;加入样品(PBS 100倍稀释1.2.2中收集的上清)及标准品(即西妥昔单抗,经PBS连续倍比稀释,500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8 ng/mL和0 ng/mL),100 μL/孔,设复孔及对照孔,37℃孵育50 min;PBST清洗拍干;用封闭液将鼠抗人IgG-HRP稀释到0.5 ng/mL,100 μL/孔,37℃孵育45 min;PBST清洗排干,加入底物显色液(TMB),100 μL/孔,37℃避光显色10 min;每孔加入50 μL终止液,在酶标仪450 nm处测OD值;绘制标准曲线,计算SF蛋白的表达量。

1.2.4 流式检测

以每孔5×106个Jurkat细胞铺六孔板,24 h后收集细胞,加入鼠抗人抗CD47-FITC 3 μL,以加入等量同型对照抗体及不添加任何抗体的细胞作为对照,避光孵育15 min后流式细胞仪测试Jurkat细胞的CD47表达量。

同理,分别以MOI=1、5和10的Ad35-SF病毒量感染Jurkat细胞,18 h后收集细胞检测感染病毒后CD47的表达量,以感染未携带目的基因的空病毒Ad35(MOI=10)的样品作为对照;以MOI=1的Ad35-SF病毒量感染Jurkat细胞,分别在感染24、48、72 h后收集细胞,检测CD47的表达量,以MOI=1感染Ad35病毒72 h后收集的样品作为对照。

1.2.5 CCK8法检测细胞增殖

将Jurkat细胞3×105/孔铺六孔板,分别加入Ad35病毒组和Ad35-SF(MOI=5)。饥饿感染2 h后,每孔补加2%的FBS和无血清的1 640培养液至终体积为3 mL,混匀后使用排枪转移至96孔板,2 000个/孔。48 h后,每孔加入10 μL CCK8,1.5 h后于450 nm测吸光值。同时,绘制Jurkat细胞的细胞数量/OD标准曲线(经1 640连续倍比稀释,12 000、6 000、1 500、750、375、187.5、93.75个/孔),根据标准曲线算出细胞数量。

1.2.6 CCK8法检测Jurkat T细胞的杀伤

将Hep3B细胞以1×104/孔铺96孔板,每孔加100 μL含10% FBS的DMEM培养液。待细胞贴壁后,移去旧培养液。根据不同效靶比(E/T=1、2、5)加入Ad35-SF病毒感染后的Jurkat-SF细胞(MOI=5),补含2% FBS的1640培养液至200 μL,并设仅接种Hep3B细胞孔,仅接种Jurkat细胞孔以及含2% FBS的1640培养液对照孔,含2% FBS的DMEM培养液对照孔。37℃、5% CO2条件下培养共培养12 h,加入CCK8试剂,30 min后在450 nm测吸光值。同时,绘制Jurkat细胞的细胞数量/OD标准曲线细胞数量曲线(经1640连续倍比稀释,500 000、250 000、125 000、62 500、31 250、15 625、7 812.5、3 906.25个/孔)。根据标准曲线求得细胞数,计算裂解率，裂解率=[(靶细胞数量+效应细胞数量-实验组细胞数量)/靶细胞数量]×100%。

2 结果与讨论

2.1 重组病毒Ad35-SF的构建与鉴定

将高亲和力结合CD47分子的SIRPα突变株CV1基因片段与人类IgG1的Fc段基因融合成SIRPα-CV1-IgG1 Fc(简称SF),使用T细胞高活性启动子TCEFI控制SF融合蛋白的表达,将该表达框插入腺病毒E1区;同时,将E3区原有的5型纤毛替换成5/35型纤毛,以增强病毒对T细胞的感染效率,构建获得的5/35嵌合纤毛、非增殖型腺病毒命名为Ad35-SF(模式见图1)。

分别以SF基因、5/35型的纤毛蛋白基因、TCEFI启动子及野毒E1A基因特异引物对包装获得的腺病毒进行PCR鉴定,理论上使用对应的引物应分别能扩增出1 143、879、1 882 bp和779 bp的片段产物。PCR片段电泳显示,4个Ad35-SF病毒株不同基因片段的扩增结果与理论结果相符,表明包装的4个Ad35-SF病毒株均正确(图2)。

2.2 病毒感染Jurkat细胞后SF蛋白的表达鉴定

使用Ad35-SF 1号克隆,MOI=1、5、10,分别感染Jurkat细胞48 h。Western blotting检测显示,分泌的SF蛋白大小约为48 kD,与理论的大小相符(因SIRPα存在转录后的不同修饰,而杂交出大小相近的两条带)(图3)。可见,随着病毒感染量的增加,SF蛋白的分泌量增强(图3)。

ELISA检测结果显示,不同MOI的Ad35-SF感染Jurkat细胞后,均能检测到SF蛋白的表达。MOI=1时,培养液中SF蛋白的分泌量为2.1 μg/mL;MOI=5时,培养液中SF蛋白的量为13.7 μg/mL;MOI=10时,培养液中SF蛋白的量达到19.0 μg/mL(图3b);在空白对照中,无病毒感染的Jurkat细胞上清没有检测到SF蛋白。表明随着Ad35-SF病毒感染量的值提高,培养液中分泌的SF蛋白量也在相应增加,其中在MOI=10时,培养液中SF蛋白的量最高,与Western blot结果相一致。

2.3 病毒感染Jurkat细胞后对其细胞表面CD47 的封闭作用检测

流式细胞仪检测结果显示,未经处理过的Jurkat细胞的CD47阳性比例为96.81%(如图4a)。MOI=1、5、10的Ad35-SF病毒感染Jurkat细胞18 h小时后,CD47的阳性率分别降为15.32%、2.94%、1.73%(如图4b)。MOI=1的Ad35-SF病毒感染Jurkat细胞24、48、72 h后,CD47的阳性率分别为3.97%、3.60%、2.36%(如图4c)。结果表明,使用Ad35-SF感染Jurkat细胞后,CD47的阳性率能显著、快速下降,表明Ad35-SF感染Jurkat细胞能通过自分泌的SF蛋白,有效封闭Jurkat细胞表面的CD47分子。

2.4 病毒Ad35-SF对Jurkat细胞的增殖影响

病毒感染细胞48 h后,在酶标仪上测得Ad35-SF组、Ad35组、空白对照组的OD值分别为0.629、0.482、0.527(如图5a),代入Jurkat细胞数量曲线可以计算出Ad35-SF组、Ad35组、空白对照组实际的细胞数量分别为5 235、3 539和4 058。相较空白对照组和Ad35组,Ad35-SF组Jurkat细胞的增殖效果分别提高29%和47.9%(p<0.01)(图5b)。

2.5 Ad35-SF病毒对Jurkat细胞杀伤Hep3B细胞 的影响

对各组的OD值进行计算,如图6,Ad35-SF组中(E/T=1、2、5)Jurkat细胞对Hep3B细胞裂解率分别为37.65%、55.30%、80.65%;Ad35组中(E/T=1、2、5)Jurkat细胞对Hep3B细胞裂解率分别为21.05%、33.70%、57%;空白对照组中(E/T=1、2、5)Jurkat细胞对Hep3B细胞裂解率分别为16.05%、28.75%、54.95%。结果表明,3个不同实验组均随着效靶比的提高,Jurkat细胞对Hep3B细胞的裂解率逐渐加强;但Ad35-SF组的裂解率在各个效靶比上均明显优于其它两组(p<0.01)。已有文献表明CD47调节着T细胞的活化与死亡,抑制T细胞CD47的表达,能促进CD8+T细胞的增殖及活化[12,14]。这就与笔者的杀伤以及增殖实验结果吻合,当Jurkat细胞表面CD47被封闭后,Jurkat细胞自身的增殖和杀伤能力被显著提高。另外,在体内封闭CD47(包括肿瘤细胞与T细胞),除能增强巨噬细胞吞噬作用外,还能够改善肿瘤微环境、增强CD8+细胞毒性T细胞在肿瘤部位的聚集,促进T细胞的增殖和杀伤[12]。因而,当将自表达SF融合蛋白的T细胞回输体内后,能通过上述多种途径增强抗肿瘤效果。但由于时间关系,我们未能及时完成相应的体内研究。

3 结 论

a) 成功构建T细胞高活性的表达系统。b) 成功构建重组腺病毒载体Ad35-SF:证实其结构正确并可在体外高效表达SF融合蛋白;c) Ad35-SF能够增强T细胞功能:在短时间内高效封闭Jurkat细胞以及CIK细胞表面CD47,并促进Jurkat的增殖以及体外杀伤肝癌细胞株Hep3B的能力。

[1] Vernon-Wilson E F, Kee W J, Willis A C, et al. CD47 is a ligand for rat macrophage membrane signal regulatory protein SIRP (OX41) and human SIRPalpha 1[J]. Eur J Immunol, 2000, 30(8): 2130-2137.

[2] Barclay A N, Brown M H. The SIRP family of receptors and immune regulation[J]. Nat Rev Immunol, 2006, 6(6): 457-464.

[3] van den Berg T K, van der Schoot C E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation[J]. Trends Immunol, 2008, 29(5): 203-206.

[4] Majeti R, Chao M P, Alizadeh A A, et al. CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells[J]. Cell, 2009, 138(2): 286-299.

[5] Chao M P, Alizadeh A A, Tang C, et al. Therapeutic antibody targeting of CD47 eliminates human acute lymphoblastic leukemia[J]. Cancer Res, 2011, 71(4): 1374-1384.

[6] Edris B, Weiskopf K, Volkmer A K, et al. Antibody therapy targeting the CD47 protein is effective in a model of aggressive metastatic leiomyosarcoma[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012, 109(17): 6656-6661.

[7] Brooke G, Holbrook J D, Brown M H, Barclay AN human lymphocytes interact directly with CD47 through a novel member of the signal regulatory protein (SIRP) family[J]. J Immunol, 2004, 173(4): 2562-2570.

[8] Irandoust M, Alvarez Zarate J, Hubeek I, et al. Engagement of SIRPalpha inhibits growth and induces programmed cell death in acute myeloid leukemia cells[J]. PLoS One, 2013, 8(1): e52143.

[9] Li Z, He L, Wilson K, et al. Thrombospondin-1 inhibits TCR-mediated T lymphocyte early activation[J]. J Immunol, 2001, 166(4): 2427-2436.

[10] Li Z, Calzada M J, Sipes J M, et al. Interactions of thrombospondins with alpha4beta1 integrin and CD47 differentially modulate T cell behavior[J]. J Cell Biol, 2002, 157(3): 509-519.

[11] Kaur S, Kuznetsova S A, Pendrak M L, et al. Heparan sulfate modification of the transmembrane receptor CD47 is necessary for inhibition of T cell receptor signaling by thrombospondin-1[J]. J Biol Chem, 2011, 286(17): 14991-15002.

[12] Soto-Pantoja D R, Terabe M, Ghosh A, et al. CD47 in the tumor microenvironment limits cooperation between antitumor T-cell immunity and radiotherapy[J]. Cancer Res, 2014, 74(23): 6771-6783.

[13] Weiskopf K, Ring A M, Ho C C, et al. Engineered SIRPalpha variants as immunotherapeutic adjuvants to anticancer antibodies[J]. Science, 2013, 341(6141): 88-91.

[14] Pettersen R D, Hestdal K, Olafsen M K, et al. Lindberg FP CD47 signals T cell death[J]. J Immunol, 1999, 162(12): 7031-7040.

(责任编辑： 许惠儿)

Effect of Self-Expression of SIRPα-Fc Fusion Protein on T Cell Function

CUI Lei1, LI Jiang2, LIU Hui2, WU Hong-ping2, LI Lin-fang2, HAO Fang-yuan2, JIN Hua-jun2, QIAN Qi-jun1,2

(1. School of Life Science, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China;2. Eastern Hepatobiliary Surgical Hospital, the Second Military Medical University, Shanghai 200438, China)

This paper investigates the effect of T cell functions after recombinant adenovirus Ad35-SF with SIRPα-Fc (SF) fusion gene and protein gene infects T cells. After adenovirus Ad35-SF infected Jurkat T cells, the magnitude and expression quantity of SF fusion protein in suspension of Jurkat T cells were detected through Western blotting and ELISA. The closure condition of CD47 was detected through flow cytometry. Cell proliferation and killing capacity to cancer cells were detected through CCK8. The results show that Ad35-SF was successfully constructed; after it infected Jurkat T cells, 48 kD SF proteins could be expressed and secreted; SF expression quantity could reach 19.1 μg/mL in the suspension of Jurkat T cells. After Ad35-SF (MOI=1) infected Jurkat cells for 18h, the proportion of CD47-positive cells dropped to 15.32% from 97.06%. When infection multiplicity of Ad35-SF increased to 5h and 10h, the proportion of CD47-positive cells further declined to 2.94% and 1.73%, respectively. Relative to the control group, the proliferation increased by 29% after Ad35-SF infected Jurkat cells for 48h, and skilling effect on hepatocellular carcinoma cell line Hep3B increased by 25.6% (p<0.01). The above results show that recombinant adenovirus Ad35-SF can effectively infect Jurkat cells, express and secrete SF protein as well as close CD 47 on cell surface. Meanwhile, it can significantly boost proliferation capacity of Jurkat cells and skilling effect on hepatoma carcinoma cells.

CD47; T cell; adenovirus; liver cancer

1673- 3851 (2015) 05- 0712- 06

2014-12-15

国家自然科学基金项目(81071850)

崔 磊(1989-),男,山西运城人,硕士研究生,主要从事靶向基因—病毒治疗方面的研究。

钱其军,E-mail:qianqj@sino-gene.com

Q789

A