高效液相色谱-蒸发光散射器法测定芪芳气血颗粒中黄芪甲苷含量

吴高芬

(湖南省岳阳市食品药品检验所，湖南 岳阳 414000 )

芪芳气血颗粒收载于国家药品标准(试行) [WS -5804 (B-0804)-2002]，由黄芪、当归、熟地黄等9 味药材组方，具有益气补血的功效。原标准用薄层扫描测定黄芪甲苷的含量，该方法受展开环境等诸多因素影响，且需显色后扫描，结果不稳定[1]，重复性也难以达到要求。为确保产品质量，笔者采用高效液相色谱-蒸发光散射器(HPLC-ELSD)法对产品中黄芪甲苷的含量进行测定，现报道如下。

1 仪器与试药

Waters Alliance 2695 型高效液相色谱仪，包括e2695 溶剂管理系统，2424ELS Detector Empower 工作站(美国Waters 公司);XS-105 型电子天平(上海梅特勒-托利多公司，精密度为0.01mg)。乙腈为色谱纯;水为纯化水;黄芪甲苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号为110781-201314，含量为95.8%);芪芳气血颗粒(恒拓集团广西圣康制药有限公司，批号为130201)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Ultimate XB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈-水(34 ∶66)[2];流速:0.9 mL/min;漂移管温度:65 ℃;增益:40;数据率:1 PPS;空气压力:20.0 psi(1 psi=6.895 kPa);柱温:30 ℃。

2.2 溶液制备

精密称取黄芪甲苷对照品12.38 mg，置25 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，制成每1 mL 含0.5 mg 的对照品溶液。精密称取本品15 g(约1 袋)，精密加水50 mL 使溶解[3]，用水饱和的正丁醇振摇，提取4 次，每次40 mL，合并正丁醇提取液，正丁醇提取液用浓氨试液[4]洗涤2 次，每次40 mL，弃去洗涤液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶液并转移至5 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。按芪芳气血颗粒处方比例取缺黄芪的方中其他药材制成阴性样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

阴性干扰试验:分别取2.2 项下3 种溶液20 μL，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图。结果显示，供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相同保留时间处有一致的色谱峰，阴性对照品溶液色谱无此吸收峰，见图1。

线性关系考察:精密吸取对照品溶液5，10，15，20，25 μL，按拟订色谱条件进样测定。以黄芪甲苷进样量的自然对数(X)为横坐标、峰面积的自然对数(Y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=1.470 3 X+4.432 5，r=0.999 6( n=5)。结果表明，黄芪甲苷进样量在2.37 ～11.86 μg 范围内与峰面积的线性关系良好。

精密度试验:精密吸取同一对照品溶液10 μL，连续进样6 次，测定峰面积积分值。结果的RSD 为0.57%(n=6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:精密吸取同一供试品溶液(批号为130201)，分别于0，3，6，9，12，24 h 时进样测定峰面积。结果的 RSD 为0.83%(n=6)，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

重复性试验:取芪芳气血颗粒(批号为130201)，依法平行制备供试品溶液6 份。精密吸取10 μL 注入高效液相色谱仪，计算黄芪甲苷的含量。结果平均含量为每袋1.41 mg，RSD 为1.32%(n=6)，表明方法重复性良好。

加样回收试验:精密称取已知含量的样品(批号为130201，每袋含量为1.41 mg)7.5 g，加入上述对照品溶液1.5 mL，精密加水50 mL 使溶解，依法制备同一质量浓度的供试品溶液6 份，进样测定，计算回收率。结果见表1。

图1 高效液相色谱图

表1 黄芪甲苷加样回收试验结果(n=6)

2.4 样品含量测定

取3 批样品，按拟订色谱条件进样测定含量。结果批号为130201，130301，130401 的样品中黄芪甲苷含量分别为每袋1.41，1.32，1.38 mg。

3 讨论

蒸发光散射器为质量型检测器[5]，适用于仅有末端吸收[6]或无紫外吸收的皂苷类化合物的测定，不受官能团的影响，不受流动相溶剂干扰，前处理简单，分离度高，回收率高，是目前测定黄芪甲苷含量较好的方法，故选择HPLC-ELSD 测定芪芳气血颗粒中黄芪甲苷的含量，并优化漂移管温度、气流速、增益、数据率等因素对峰形的影响，有效保证测定方法的灵敏度及准确性。

黄芪甲苷为环菠萝蜜烷型四环三萜类皂苷。皂苷在含水丁醇或戊醇中溶解度较好[7]，且样品中的黄芪甲苷已被提取，直接加水溶解，用水饱和的正丁醇提取，且正丁醇提取液一般不含单糖、多糖等杂质，便于分析。

曾采用浓氨试液(每次40 mL，2 次)与氨试液[5](每次40 mL，2 次)及1%氢氧化钠溶液[8](每次20 mL，4 次)洗涤正丁醇提取液，结果同体积的浓氨试液及1%氢氧化钠溶液提取黄芪甲苷的量较氨试液约多1 倍。在碱性环境下，黄芪皂苷Ⅰ和Ⅱ向黄芪甲苷Ⅳ转化[9]。在一定碱性范围内，碱性越强，黄芪皂苷Ⅰ和Ⅱ向黄芪甲苷Ⅳ转化越完全。

[1] 李镜友，陈 军，罗巧红，等. HPLC-蒸发光散射检测法测定益气温阳胶囊中黄芪甲苷的含量[J] . 中医药导报，2009，15(7):86.

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[6] 匡海学. 中药化学[M]. 北京:中国中医药出版社，2003:240.

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[8] 吴永平，徐永梅，曹 园，等.HPLC-ELSD 法测定黄芪提取物中黄芪甲苷的含量[J]. 中成药，2001，23(9):674.

[9] 汪 祺，张聿梅，戴 忠，等. 黄芪中皂苷类成分的特征薄层图谱鉴别[J] . 中国药事，2011，23(12):1 229.