三种复合菌对无抗全价饲料的固体发酵研究

■周小玲 舒 燕 周映华，2 胡新旭，2 高书锋，2 王升平，2 曾发娇 缪 东 刘惠知 张德元

（1.湖南省微生物研究院，湖南长沙 410009；2.饲用微生态制剂湖南省工程试验室，湖南长沙 410009）

固态发酵是在一定湿度的固态基质中，利用一种 或多种微生物进行的一个生物反应过程，因其操作简便、发酵过程比较容易控制而受到规模化发酵生产应用的青睐。混菌固体发酵是采用多种微生物进行的固体发酵，与单菌种发酵相比，发酵菌种之间可互相取长补短，将各菌优势发挥到最大。混菌发酵常用的菌种有霉菌、酵母菌、乳酸菌等。酵母菌固体发酵产物富含蛋白质和多种酶，且具有特殊香味，适口性较好。而乳酸菌是一类能以糖为原料，发酵产生大量乳酸等有机酸的微生物，它是正常人畜肠道中非常重要的菌群，能发酵碳水化合物产生大量的乳酸，抑制有害细菌生长，具有维持肠道菌群的微生态平衡，增强机体免疫功能，提高饲料利用率等功能，被广泛用于微生态制剂。本研究利用发酵袋，选用副干酪乳杆菌、酿酒酵母及枯草芽孢杆菌进行复合微生物固体发酵，研究三菌复合固体发酵后含菌数、营养成分等的变化规律，为复合菌固体发酵规模化生产应用提供一定的参考。

1 材料

1.1 菌种

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtili)、酿酒酵母（Sac⁃charomyces cerevisiae）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）均由本实验室分离保存。

1.2 培养基

LB∶蛋白胨10 g/l、牛肉膏3 g/l、NaCl 5 g/l，pH值7.2，121℃灭菌30 min备用；

土豆葡萄糖培养基：土豆20%、葡萄糖2%，pH值自然，121℃灭菌30 min备用；

MRS培养基：蛋白胨10 g/l、牛肉膏8 g/l、酵母膏4 g/l、葡萄糖 20 g/l、MgSO4·7H2O 0.2 g/l、MnSO4·H2O 0.03 g/l、吐温-80 1 ml/l，pH值自然，121 ℃灭菌20 min备用。

麦康凯琼脂、SS琼脂购自广东环凯微生物科技有限公司，按照说明书进行配制使用。

1.3 主要试验仪器设备

超净工作台、高压灭菌锅、生化培养箱、pH计、紫外可见分光光度计、摇床等。

2 试验方法

2.1 枯草芽孢杆菌、酿酒酵母及副干酪乳杆菌发酵液的制备

取枯草芽孢杆菌单菌落接种LB斜面，于30℃生化培养箱恒温培养活化，待枯草芽孢杆菌斜面长好，用接种环刮取两环菌苔转入装有100 ml LB三角瓶中，30℃摇床振荡培养18～24 h备用；将4℃保存条件下酿酒酵母斜面活化，转接到装有100 ml土豆葡萄糖培养基的三角瓶中，28℃摇床振荡培养28～30 h备用；副干酪乳杆菌活化，取冷冻保存副干酪乳杆菌复活，转接到装有100 ml MRS培养基的三角瓶中，37℃生化培养箱静置培养48 h备用。

2.2 枯草芽孢杆菌、酿酒酵母及副干酪乳杆菌混菌发酵工艺

将制备好的枯草芽孢杆菌、副干酪乳杆菌和酿酒酵母发酵液按1∶1∶1混合，发酵液接种比例3%（按照全部成分计算），与水混匀后（菌液和水含量合计40%），加入全价乳猪配合粉料（不添加抗生素，固态料比例为60%）中混合均匀，装袋密封，室温存放。每隔一定时间取样，测定发酵产物pH值及其中枯草芽孢杆菌、副干酪乳杆菌和酿酒酵母含量；测定粗蛋白、粗纤维及小肽含量；测定发酵产物中有机酸（乳酸、乙酸、柠檬酸）及酶（蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、植酸酶）含量；检测发酵饲料中有害微生物——大肠杆菌、沙门氏菌数量。

2.3 测定方法

枯草芽孢杆菌含菌数：LB平板计数法；副干酪乳杆菌含菌数：MRS平板计数法；酵母菌含菌数：土豆葡萄糖平板计数法；大肠杆菌含菌数：麦康凯平板计数；沙门氏菌含菌数：SS琼脂平板计数法。

总Ca含量：参照GB/T 6436—2002饲料中钙的测定；总P含量：参照GB/T6437—2002饲料中总磷分光光度法测定；pH值：pH计法；粗蛋白含量：参照GB/T 6432—1994饲料中粗蛋白测定方法测定；粗纤维含量：参照GB/T 6434—2006饲料中粗纤维测定方法；小肽含量：考马斯亮蓝法；乳酸、柠檬酸、乙酸：液相色谱法测定，乳酸、柠檬酸色谱条件：流动相，乙腈∶0.1%磷酸溶液=1∶39，流速1.0 ml/min，检测波长210 nm，进样量20 μl，乙酸色谱条件：流动相，0.002 0 mol/l H2SO4溶液，流速 1.0 ml/min，检测波长2.6 min前210 nm，2.6 min后300 nm，进样量10 μl；蛋白酶：参照 GB/T 23527—2009 测定；纤维素酶：参照NY/T 912—2004饲料添加剂纤维素酶活力的测定分光光度法进行；淀粉酶：参照GB/T 5521—2008进行；植酸酶：参照GB/T 18634—2009分光光度计法进行。

3 结果

3.1 复合菌固体发酵过程中枯草芽孢杆菌、副干酪乳杆菌、酿酒酵母含菌数的变化(见图1～图3)

图1 不同发酵时间副干酪乳杆菌含菌数变化（发酵饲料湿基计算）

图2 不同发酵时间酿酒酵母含菌数变化(发酵饲料湿基计算)

图3 不同发酵时间枯草芽孢杆菌含菌数变化（发酵饲料湿基计算）

随着发酵时间延长，发酵饲料中副干酪乳杆菌含菌数显著增加，在发酵第5～10 d含菌数最高（如图1），达3.6×109cfu/g，后随着发酵时间延长，副干酪乳杆菌含菌数逐渐下降；饲料中酿酒酵母在发酵第5 d含菌数最高，5 d后随着发酵时间的延长含菌数降低，随着副干酪乳杆菌的大量繁殖，发酵饲料中有机酸的产生，pH值下降，在发酵31 d后基本检测不到酿酒酵母活菌（如图2）；枯草芽孢杆菌在发酵第5 d略有增加，由于枯草芽孢杆菌虽然可以形成抗逆性强的芽孢，但生长还是受到了一定影响，在发酵10 d后开始下降（如图3）。

3.2 复合菌固体发酵过程中粗蛋白等营养成分含量的动态变化（见图4～图5）

图4 不同发酵时间粗蛋白含量变化（发酵饲料湿基计算）

图5 不同发酵时间小肽、粗纤维、总钙、总磷含量变化（发酵饲料湿基计算）

随着时间延长，发酵产物中粗蛋白有增加趋势（如图4），而发酵饲料中总钙质和总磷含量一直保持稳定水平，小肽含量随着发酵时间延长略有增加，而其中粗纤维在发酵前期略有降低（如图5）。

3.3 复合菌固体发酵过程中有机酸含量的动态变化

随着发酵时间延长，乳酸菌的大量繁殖，产生了大量有机酸，乳酸在发酵第31 d时含量达到最高值(1 395.9 μg/g)，此后略有下降，而乙酸和柠檬酸均在发酵第75 d时达到最高值，分别为978.7 μg/g和1 157.8 μg/g，3种有机酸均保持在一定水平（如图6）。因乳酸菌的大量繁殖，有机酸的不断产生，发酵产物pH值自发酵开始后下降，在第10 d达到4.32，此后稳定在此水平（如图7）。

图6 不同发酵时间有机酸含量变化（发酵饲料湿基计算）

图7 不同发酵时间pH值变化

3.4 复合菌固体发酵过程中蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、植酸酶含量的动态变化

在发酵第10 d开始检出蛋白酶，在发酵一个月时达到最高，为125.4 U/g，随后随着含菌数开始下降，蛋白酶含量下降，到发酵75 d时已检测不到，纤维素酶先上升后下降，在发酵1个月后检测不到（如图8），而发酵过程中始终未检出淀粉酶和植酸酶。

图8 不同发酵时间酶含量变化（发酵饲料湿基计算）

3.5 复合菌固体发酵过程中大肠杆菌、沙门氏菌的动态变化

对发酵过程中有害菌进行了检测，发现大肠杆菌随着发酵时间延长而下降，发酵1个月后检测不到大肠杆菌，而沙门氏菌始终未被检出。可能是随着副干酪乳杆菌的大量生长，有机酸的产生，pH值降低，对有害细菌生长产生抑制，使得饲料中大肠杆菌大大降低，最后检测不到（如图9）。

图9 不同发酵时间有害菌含量变化（发酵饲料湿基计算）

4 讨论

与液体发酵相比，固体发酵有着许多优点，如简单的生产工艺,同时在发酵生产过程无废水、废气等废弃物的产生,成本低、能耗少，且环保等。而全价发酵饲料是将微生物和水一起加到全价无抗配合饲料中，在适当温度下发酵而成。该饲料可满足动物营养需要，同时富含多种有机酸、维生素和益生菌。不但可以有效地节约成本，还能促进动物生长、增强动物疾病抵抗力等。

目前应用于固体混合发酵菌种组合主要为霉菌与酵母菌组合、乳酸菌与芽孢杆菌组合、芽孢杆菌与酵母菌组合等，应用乳酸菌、酵母菌及芽孢杆菌组合固体混合发酵研究较少。本研究采用副干酪乳杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌进行三菌复合固体发酵全价饲料，发酵在密封的带呼吸膜的发酵袋中进行。因发酵是在密封的发酵袋中进行，而酿酒酵母和枯草芽孢杆菌为需氧菌，发酵开始，酿酒酵母和枯草芽孢杆菌生长将发酵袋中氧气消耗完，提供了厌氧环境，有利于副干酪乳杆菌的生长。在整个发酵过程中，副干酪乳杆菌生长处于优势，同时产生大量乳酸、乙酸等有机酸，使发酵物料pH值维持在较低水平，随着发酵时间的延长，在发酵31 d后没有检测到酵母活菌；而枯草芽孢杆菌由于虽然可以形成抗逆性强的芽孢，但生长还是受到了一定影响，在发酵10 d后开始下降。

应用副干酪乳杆菌进行混合固体发酵饲料方面的研究也较少，主要集中在干酪乳杆菌的研究。张军等(2011)采用干酪乳杆菌和罗伊氏乳杆菌以麸皮等为基质进行固态混合发酵，4 d后活菌数达3×109cfu/g，本研究三菌固态发酵后副干酪乳杆菌活菌数在发酵10 d后达3.6×109cfu/g，固体发酵水平相当。一般来说活菌数是影响益生菌益生效果的主要因素，一般要求每克要达到108个菌体才有效。本研究中一直到发酵60 d，副干酪乳杆菌含量均在1.01×108cfu/g以上。马治宇（2008）、徐基利等（2010）研究表明，乳酸菌菌粉能够显著抑制大肠埃希菌的繁殖，本次试验过程中随着发酵时间的延长，全价配合饲料中有害菌大肠杆菌下降，最后检测不到。

在整个全价料混菌固体发酵过程中粗蛋白和小肽含量略有上升，而粗纤维含量未有明显下降，表明副干酪乳杆菌、酿酒酵母及枯草芽孢杆菌三菌组合对粗纤维降解能力较差。复合益生菌固态混合发酵的菌种配比及其益生作用机理还有待进一步的研究。

5 结论

本试验研究表明，可以用副干酪乳杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌对无抗全价猪料进行三菌复合固体发酵，可以适当增加发酵后饲料中粗蛋白和小肽含量，显著降低pH值，提高乳酸菌含量，降低有害菌大肠杆菌含量，发酵效果以5～10 d最优。

（参考文献若干篇，刊略，需者可函索）