通心络对脑缺血再灌注损伤的保护作用研究

郑超波 刘建荣

●基础研究

通心络对脑缺血再灌注损伤的保护作用研究

郑超波 刘建荣

目的 研究通心络对脑缺血再灌注损伤小鼠脑组织神经保护作用的机制。方法 将126只成年雄性小鼠按随机数字表法分为全程给药组、预处理组及对照组，每组各42只，均建立脑缺血再灌注损伤模型。全程给药组于造模前7d每天连续给予12.5ml/kg剂量的通心络溶液（0.08g/ml），造模后继续给予相同剂量的通心络至各处死时间点或实验终点；预处理组造模前给药同全程给药组。对照组于造模前7d连续给予等体积的0.9%氯化钠溶液。对造模后1、3、7和14d小鼠脑缺血损伤后神经行为学改变进行改良神经功能评分，并测定造模后1d和3d脑梗死体积、脑组织含水量及细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-αmRNA水平。结果 全程给药组、预处理组造模后1、3、7、14d的神经功能评分均较对照组低，但仅全程给药组与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；全程给药组、预处理组造模后1、3d的脑梗死体积及脑组织含水量均较对照组小，但仅全程给药组与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；全程给药组造模后1、3d脑组织中IL-6和IL-1βmRNA水平较对照组低,差异有统计学意义（均P＜0.05）,TNF-α mRNA水平虽较对照组低，但差异无统计学意义（P＞0.05），预处理组中各时点IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA水平均较对照组高，但差异无统计学意义（均P＞0.05）。结论 通心络对脑缺血再灌注损伤有神经保护作用，其作用机制可能是减轻了脑组织中的炎症反应。

通心络 脑缺血 炎症因子 IL-6 IL-1β TNF-α

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of Chinese medicine Tongxinluo on cerebral ischemia reperfusion injury in mice.Methods Adult male mice(n=126)were randomly divided into 3 groups:treatment group,pretreatment group and control group(n=42 in each group).Cerebral ischemia reperfusion was induced by suture method.Tongxinluo,made into revolution of 0.08g/ml,12.5ml/kg was administered by gavage daily for 7days before surgery in treatment and pretreatment groups,same volume of normal saline was given into mice in control group.Tongxinluo 12.5ml/kg was aslo adminstered to mice in treatment group after surgery until the animals were sacrificed.The neurological function scores were evaluated at d1,d3,d7,d14 after surgery;the brain infarct volume,brain water content and the expression of IL-6, IL-1β,TNF-αmRNA in brain tissue were determined at d 1 and d3 after surgery. Results Compared with the control group,the nerve function scores at d1,d3,d7,d14 after surgery in treatment group were significant lower(P＜0.05).Compared with control group,the volume of cerebral infarction and the water content of brain tissue at d1,d3 after surgery in treatment group were significantly reduced(P＜0.05).Compared with the control group,the expression of IL-6 and IL-1βmRNA in brain tissue of treatment group was significantly lower(P＜0.05). Conclusion Chinese medicine Tongxinluo can protect brain tissue from ischemia reperfusion injury and reduce brain inflammation in mice.

通心络胶囊由12种传统中药成分按照一定比例混合而成，已被中国食品药品监督管理局批准用于治疗糖尿病、冠心病等多种疾病；研究证实通心络胶囊有抗血小板以及保护血管作用[1-2]。临床研究还发现，通心络胶囊对缺血性脑卒中有一定治疗作用，但是其神经保护作用的机制尚未明确。本研究采用小鼠脑组织缺血再灌注模型，观察通心络粉剂减少缺血再灌注后的脑梗死体积、减轻脑水肿及改善神经功能评分的效果，进一步探索通心络粉神经保护作用的机制。

1 材料和方法

1.1 药物准备 将通心络胶囊（石家庄以岭制药有限公司，国药准字Z20060322）粉剂（直径≤10μm）溶解于0.9%氯化钠溶液中，配置成浓度为0.08g/ml的溶液储存于4°C冰箱中。每次给药时提前30min取出，待复温至室温时按照实验设计中的分组和剂量进行灌胃给药。

1.2 实验动物和分组 成年雄性小鼠126只（由上海斯莱克实验动物有限公司提供，合格证号 SCXK（沪）2013-0016，2级，体质量25～30g），按随机数字表法分为3组，每组42只。（1）预处理组：于造模前7d连续给予12.5ml/kg剂量的通心络溶液（0.08g/ml）直至手术前1d。（2）全程给药组：于造模前7d连续给予12.5ml/kg剂量的通心络，造模后继续给予相同剂量的通心络至各处死时间点或实验终点。（3）对照组：于造模前7d连续给予等体积的0.9%氯化钠溶液。每组小鼠分别在造模后1、3d时各处死18只，用于脑梗死体积、脑组织含水量及炎症因子（IL-6、IL-1β和TNF-α）mRNA表达水平的测定（每项测定每组各6只）；每组剩余的6只小鼠于造模后1、3、7、14d观察神经功能评分。

1.3 脑缺血再灌注模型建立 将6-0栓线的尖头靠近高温烧灼器烧成圆头，切割1.5cm，然后将栓线伸入含有硅橡胶的PE-10管中，包裹长度约2.0mm，沾有硅橡胶的线拴直径约为0.25mm，自然晾干。手术参考既往文献介绍的方法，将线栓从左侧颈外动脉处逆行插向颈总动脉的分叉处，再将线栓转至颈内动脉腔，动作轻缓小心地经颅内段颈内动脉插入至感到轻微阻力，进线深度为（0.90±0.05）cm，用套线将线栓固定在颈外动脉残端，90min后拔出线栓。在手术过程中，利用热毯将小鼠的体温保持在37℃左右[3]。造模成功的标准为：线栓阻塞大脑中动脉（小鼠前囟旁开2mm）血流量后下降至阻塞前的20%以下，拔出后恢复至原来的80%以上；动物苏醒后表现为下列体征之一：站立和爬行时出现右侧倾倒和右侧划圈，左侧的眼裂减小（Horner征），提尾时出现右侧前肢的内收及屈曲。

1.4 小鼠神经功能评分 对造模后1、3、7和14d小鼠脑缺血损伤后神经行为学改变进行改良神经功能评分（根据小鼠的运动、感觉、平衡及反射综合评分[4]），包括提尾（0～3分）、爬行（0～3分）、平衡木实验（0～6分）以及反射缺失（0～2分），总分0～14分，分数越高损伤程度越重。

1.5 脑梗死体积测定 采用焦油紫染色法，将取出的小鼠脑组织保存在-40°C的异戊烷中，用冷冻切片机切取20μm的脑组织冠状切片。将切片浸入含有0.05%焦油紫的染色缸中染色，采用Image J软件测定脑片中相应面积，并按已有计算公式获得整个脑组织的梗死体积[5]。

1.6 脑组织含水量测定 小鼠在造模后1d和3d用过量10%水合氯醛深度腹腔麻醉，取出脑组织，分析天平上秤量其湿重，在100°C真空干燥箱中脱水24h，并再次称取干重。脑组织含水量（%）=[（湿重-干重）/湿重]×100%。

1.7 脑组织中炎症因子mRNA表达水平测定 使用TRIzol试剂盒（美国Invitrogen公司）提取脑组织中的总RNA，并根据试剂盒要求溶于40μl去除RNA酶的离子水中。微量分光光度仪（美国Thermo公司，NanoDrop1000型号）检测总RNA纯度及浓度。扩增过程使用快速RT-PCR系统（美国ABI公司，7900HT型）和SYBR Premix Ex Tag试剂盒（中国宝生物公司）。总共3个过程，分别为一个循环的预变性：95°C 30s，40个循环的变性：95°C 5s，退火、延伸：60°C 30s。以管家基因GAPDH为内参，校正每个样品的Ct值，以2-ΔΔCt值的均数作统计图，2-ΔΔCt值的均数代表IL-6、IL-1β及TNF-α mRNA炎症因子的标准化数目。

1.8 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件，计量资料以表示，组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 3组小鼠神经功能评分及梗死体积的比较 见表1、2。

表1 3组小鼠神经功能评分比较

表2 3组小鼠脑梗死体积比较（mm3）

由表1可见，全程给药组、预处理组造模后1、3、7、14d的神经功能评分均较对照组低，但仅全程给药组与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），而预处理组与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

由表2可见，全程给药组、预处理组造模后1、3d的梗死体积均较对照组小，但仅全程给药组与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），而预处理组与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 3组小鼠梗死侧脑组织含水量的比较 见表3。

由表3可见，全程给药组、预处理组造模后1、3d梗死侧皮层与基底核的含水量均较对照组少，但仅全程组与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），而预处理组与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 3组小鼠梗死侧脑组织含水量的比较（%）

2.3 3组小鼠脑组织中炎症因子mRNA表达水平比较 见表4。

表4 3组小鼠脑组织中炎症因子mRNA表达水平的比较

由表4可见，全程给药组造模后1、3d脑组织中IL-6和IL-1βmRNA表达水平较对照组低,差异有统计学意义（均P＜0.05），TNF-α mRNA表达水平虽较对照组低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。预处理组中各时点IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达水平均较对照组高，但差异无统计学意义（均P＞0.05）。

3 讨论

缺血性脑损伤的炎症反应是由多种细胞因子介导的一种级联反应过程，炎症反应是造成脑缺血再灌注损伤的主要原因。局部炎症因子的表达上调构成了缺血损伤向炎症性损伤转变的基础，随后白细胞向缺血区的聚集和浸润导致了继发性神经元损伤和梗死面积的扩大。

IL-1在机体感染、损伤、炎症及免疫反应等过程中起关键作用，存在形式有IL-1α和IL-1β，其中IL-1β是一种多效性的细胞因子，是脑I/R中触发炎症反应的重要介质之一，主要由血管内皮细胞、胶质细胞、神经元等活化表达[6]。生理条件下，脑内IL-1β水平很低，脑缺血后IL-1β表达上调，可刺激细胞黏附分子的产生，引起中性粒细胞聚集，诱导多种细胞因子的表达[7]。研究证实，而IL-1受体拮抗剂能减小脑梗死灶体积，减轻血脑屏障损害，抑制小胶质细胞活化及中性粒细胞浸润，对脑缺血有神经保护作用[8]。

TNF-α是缺血再灌注损伤中起重要作用的炎性细胞因子，人体内正常水平的TNF-α可介导抗肿瘤及调节机体的免疫功能，在机体对疾病的防御及损伤修复等过程中起着重要作用，但是TNF-α产生过多反而会加重脑细胞损害，通过介导炎性反应，直接的细胞毒性反应及促凝等作用参与缺血性脑损害的发生、发展，可能会增加局部梗死灶的敏感性和危险性。脑缺血后，脑组织中增高的TNF-α可直接破坏血脑屏障，使其通透性增加，引起脑细胞特别是星形胶质细胞的肿胀和变性，继而释放花生四烯酸代谢产物、氧自由基、脂质过氧物等各种神经毒性因子，并进一步加重细胞毒性水肿[9]。

研究证实IL-6对急性脑缺血后脑损伤的作用包括：（1）诱导缺血区B细胞、T细胞分化，增强免疫应答。（2）抑制TNF-α分泌，促进星形细胞有丝分裂，协同神经生长因子保护胆碱能神经元及儿茶酚胺能神经元，并促进其生长，都提示IL-6对脑缺血后有神经保护作用[10]。虽然也有研究发现缺血后外周血中IL-6升高的水平与脑梗死范围及神经功能损伤程度呈正相关[11]，但是目前多数观点认为IL-6对于脑缺血有神经保护作用。

虽然目前大量的研究都证实通心络对脑缺血有神经保护作用，但是其有关机制目前知之甚少。本次研究中我们发现通心络能减小脑缺血再灌注后梗死体积，减轻梗死侧水肿程度，并且改善缺血后神经功能缺损程度；并且通过后面的研究发现通心络全程给药组减少脑缺血后炎症因子IL-1β的表达，提示减少缺血后炎症反应是通心络的神经保护作用机制；但是同时发现，两种不同给药方式对具有神经保护作用的炎症因子IL-6的不同影响以及预先给予通心络增加缺血后炎症因子IL-1β的表达，提示通心络对缺血后神经保护作用还可能有其他机制的参与，如对氧化应激、氧自由基及神经凋亡等方面；预先服用通心络可以促进IL-6的表达，提示通心络也可能应用于脑缺血的二级预防中。通过本次研究为通心络在治疗脑梗死临床应用提供一定的理论依据，通心络对脑缺血后的神经凋亡、氧化应激等方面的研究及影响炎症因子机制的研究尚还需进一步的研究。

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（本文编辑：杨丽）

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本刊编辑部

Protective effects of Chinese medicine Tongxinluo on cerebral ischemia reperfusion injury in mice

ZHENG Chaobo，LIU Jianrong.
Department of Neurology,Rui Jin Hospital Jiao Tong University School of Medcine,Shanghai 200025,China

Tongxinluo Cerebral ischemia Inflammatory cytokines IL-6 IL-1β TNF-α

2014-12-08）

200025 上海交通大学附属瑞金医院神经内科（郑超波、刘建荣，郑超波现在浙江医院神经内科工作）