云南竹类植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(P E P C)含量比较*

唐国建，林树燕，王曙光

(1．西南林业大学，云南 昆明650224;2．南京林业大学，江苏 南京210037)

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PEPC)是光合作用C4途径中的关键酶之一，广泛分布于高等植物叶肉细胞的细胞质中［1］。但PEPC并不是C4植物专属酶，根据目前相关研究，无论C3植物还是C4植物均含有PEPC，不过类型不同［2］。近年来，也有人认为C3植物中可能存在着C4光合途径。Duffus等［2］在研究C3植物大麦时发现其颖片中含有高于叶片中的PEPC含量，提出了C3植物中可能有C4途径存在的假设;而后Nutbeam等［3］利用14C同位素示踪技术证实了C3植物大麦中确实存在C4途径;后来学者们陆续在其他C3植物中发现了C4途径的存在［4～20］;通过同位素示踪技术和LED技术，从酶学和四碳酸代谢两方面研究证明，C3植物中确实存在C4途径，而且同种植物中C4途径的强弱在不同品系间以及不同器官中也有较大的差异［3～4，7～8，15］。李卫华等［4］发现高等植物中碳同化的两种类型 (C3途径和C4途径)是相互联系的，且在一定条件下可以相互转化，C3、C4植物的划分也并非绝对。

PEPC既存在于C4植物中，也在许多C3植物中发现［4～16］。PEPC 在 C3植物中可能具有将呼吸作用产生的CO2重新固定，生成苹果酸、天冬氨酸等有机酸，或者在三羧酸循环中回补草酰乙酸的功能等，但目前还无法得到确切的答案［4，8～9］。提高C3植物C4途径同化CO2的强度将是以后研究热点，然而，过去对PEPC的活性、结构和功能进行了大量研究［1～22］，却从未对植物体内PEPC含量的差异进行研究。

本研究就竹类植物4属8个竹种的成熟叶和云南箭竹在温室内、温室外的衰老、成熟、幼嫩3个叶龄阶段的叶片中PEPC含量的差异进行研究，测定了竹类植物种间PEPC含量的变化，分析竹种间PEPC含量的差异及原因，探讨PEPC含量在竹子种属分类中作为区分标准的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究分别选取箭竹属 (Fargesia)的云南箭竹 (F．yunnanensis)、棉花竹 (F．fungosa)和元江箭竹 (F．yuanjiangensis)，牡竹属 (Dendrocalamus)的勃氏甜龙竹 (D．brandisii)和龙竹(D．giganteus)，箣竹属 (Bambusa)的青皮竹(B．textilis)和佛肚竹 (B．ventricosa)以及刚竹属(Phyllostachys)的 紫 竹 (P．nigra)和 毛 竹(P．heterocycla)，共4属9个竹种作为试验材料，所有材料均取自西南林业大学竹园内。选取新鲜健康无虫害、叶龄基本一致的叶片，洗净去主脉，用滤纸吸干水分，用自封袋装好，保存于4℃冰箱中，备用。

1.2 方法

1．2．1 PEPC 的提取

PEPC的提取参考《植物生理学实验技术教程》［23］的方法，并略有改动。即称取2～3 g叶片，用洁净的剪刀剪碎，置于研钵中加入液氮进行研磨，最后按1︰3～1︰5(M/V)的比例加入pH 7．0的柠檬酸-磷酸缓冲液，研磨15 min，研磨充分后，尽量将匀浆液全部转入15 mL离心管，5 000 rpm冷冻离心20 min，取上清液，即为粗酶液，将其分装于1．5 mL离心管中，置于4℃冰箱中保存，备用。

1．2．2 PEPC 含量测定

按照植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PEPC)ELISA检测试剂盒 (上海丽臣生物科技有限公司)的说明书，通过雷杜RT-6100酶标仪对PEPC含量的进行定量测定。即PEPC ELISA试剂盒室温平衡20 min后，取出所需板条，设置标准孔、样本孔和空白孔;标准孔中依次加入50 μL浓度为80 IU/L、40 IU/L、20 IU/L、10 IU/L、5 IU/L、2．5 IU/L 的标准品，空白孔什么都不加，样本孔预先加样本稀释液40 μL，再加入待测样品10 μL;随后在标准孔和样本孔中加入辣根过氧化物酶标记的抗体(抗原来源于拟南芥)100 μL，空白孔不加，用封板膜封住反应孔，37℃水浴60 min;去液体，在吸水纸上拍干液体，再加满洗涤液，并静置1 min，甩去洗涤液，再次拍干，如此重复5次;往所有孔中加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min;最后往所有孔中加入反应终止液50 μL，15 min内使用酶标仪在450 nm波长处测定各孔的OD值。

1．2．3 数据处理与分析

统计雷杜RT-6100酶标仪定量检测的PEPC含量值，用SPSS 19．0软件进行方差分析和多重比较。

表1 不同竹种的成熟叶片中PEPC含量Tab．1 The variation of PEPC contents from the mature leaves in different bamboo plants 1×10-3 IU/g·FW

2 结果与分析

2.1 温室内外云南箭竹成熟叶片中PEPC含量

温室外的云南箭竹成熟叶片中PEPC含量显著高于温室内的，说明环境因子对云南箭竹成熟叶片PEPC含量的影响较大，同时在温室内高温、高湿的环境下，PEPC含量却呈下降趋势，因此，可以推测竹类植物应属于C3植物，PEPC含量与植物碳同化途径没有相关性。

表2 云南箭竹叶片中PEPC含量Tab．2 The variation of PEPC contents from the leaves of F．yunnanensis 1×10-3 IU/g·FW

2.2 不同叶龄云南箭竹叶片中PEPC含量

云南箭竹成熟叶中PEPC的含量最高，其次为嫩叶，老叶中含量最少，且老叶与中叶和嫩叶的差异均显著 (表2)。PEPC出现这种变化趋势，与竹叶的发育阶段有直接关系，中叶和嫩叶的代谢能力强于老叶，各种酶合成的能力高于老叶，也表明植物的不同发育阶段对PEPC含量造成了显著影响。

2.3 箭竹属不同竹种间成熟叶片中PEPC含量

对箭竹属不同竹种间成熟叶片中PEPC含量进行多重比较 (表1)，表明箭竹属的3种竹种间PEPC含量差异均显著，含量最高的为云南箭竹，其次为棉花竹，最低的为元江箭竹。

2.4 不同竹种间成熟叶片中PEPC含量

箭竹属的元江箭竹 PEPC含量最低 (表1)，刚竹属的紫竹PEPC含量最高。不同竹种间成熟叶片中的PEPC含量有些差异并不明显，如同属间的勃氏甜龙竹与龙竹，毛竹、棉花竹、青皮竹和佛肚竹4者间;有些差异明显，如元江箭竹、云南箭竹及紫竹与另外8个竹种之间。特别是刚竹属中的2个竹种间PEPC含量差异最为显著，紫竹的PEPC含量竟是毛竹的2倍以上;箭竹属的3个竹种、刚竹属的2个竹种间成熟叶片中PEPC含量均存在显著差异。而牡竹属的2个竹种间、箣竹属的2个竹种间的PEPC含量差异均不明显。因此不同竹种间成熟叶片中的PEPC含量存在显著差异。

2.5 不同属间成熟叶片中PEPC含量

对不同属的竹类植物间成熟叶片中PEPC的含量进行比较，发现箣竹属的PEPC含量最低，刚竹属的PEPC含量最高 (表1)。进行多重比较得出，刚竹属竹子成熟叶片中PEPC含量，除与牡竹属中的差异不显著外，均与另外2个属存在显著差异;而牡竹属竹种成熟叶片中的PEPC含量与其他3个属间的差异均不显著。刚竹属中的毛竹、紫竹通常分布在低海拔、高纬度、凉性气候的环境中，而箭竹属竹种通常分布在低纬度、高海拔、凉性气候环境之中，可能是海拔和纬度的不同对不同属间的PEPC含量造成了遗传上的差异。另外，箣竹属和牡竹属的竹子通常分布在低纬度、低海拔、暖性气候的环境中，其成熟叶片中PEPC含量差异不明显，可能是由于这2个属的竹子在生境上分布是重叠的原因所造成的。

3 结论与讨论

不同竹种间的PEPC含量差异较大，同种竹子不同叶龄之间和不同环境下，PEPC含量也存在着差异。

学者们对PEPC的活性和结构进行了大量的研究［1，4，7～22］，而对 PEPC 含量的研究相对较少，施教耐等［17，19］和吴敏贤等［18，20～21］对植物 PEPC 进行了一系列的研究，得到了较高纯度的酶制剂，并对其酶学性质进行了大量的研究;査静娟等［22］对高粱叶片中PEPC进行了分离纯化，得到了具有4个相同亚基，分子量为380 kDa的蛋白质，并认为不同植物的PEPC可能在结构上存在着差异;郝乃斌等［7～8］认为植物PEPC的活性在同一物种不同品种间存在差异;魏爱丽等［14～15］对小麦不同绿色器官光合速率与碳同化酶活性及其基因型差异进行了研究，认为小麦不同器官中PEPC的活性在不同发育时期存在差异，非叶器官可能具有较强的C4光合机制;李卫华等［4］总结前人的研究结果，认为不同物种间PEPC的活性存在差异，环境因素和不同发育阶段也是PEPC的显著影响因素。

所有试验材料均取自西南林业大学竹园内，避免了因生长地理环境因子的差异对PEPC含量的影响，同时，通过比较云南箭竹成熟叶片中PEPC含量在温室内与温室外的变化情况，发现温室内的PEPC含量明显低于温室外的，进一步说明环境对PEPC含量的影响较大;然而温室内高温、高湿的环境，并没有促使PEPC含量的增加，反而出现下降的趋势，因此，可以推测竹类植物因属于C3植物，PEPC含量与植物碳同化途径没有相关性。另外，李卫华等［5～6］对C3植物大豆不同发育时期叶片中C4循环途径的相关酶进行了研究，发现PEPC在各个发育时期均存在，从苗期到初荚期，PEPC的活性呈逐渐升高的趋势，且不同品种间的活性差异也较大。云南箭竹不同叶龄中的PEPC含量也随着叶龄的增长，呈先上升后下降的趋势，说明不同发育阶段的叶片中PEPC含量差异显著。

其次，箭竹属3种竹子成熟叶片中的PEPC含量差异也较大，含量最高的为云南箭竹，其次为棉花竹，元江箭竹的PEPC含量最低，且3者间差异较为明显。从竹子的地理种源来看，云南箭竹主要分布在四川西南部、云南北部，生长海拔在1 700～2 600 m［24］，其成熟叶片中PEPC含量最高;元江箭竹主要分布在云南南部的元江、石屏等地［24］，生长海拔在1 600 m左右的干热河谷地带，其PEPC含量最低，从南至北，从低海拔至高海拔，PEPC含量有上升的趋势，纬度和海拔的变化对PEPC含量造成了显著影响，暗示环境可能对不同竹种的遗传基因造成影响，从而引起不同竹种PEPC含量的显著差异。另外，在其他C3植物中(如小麦)，也有报道过，干旱胁迫对PEPC的活性造成显著的影响［14］，其次，小麦的品种及不同器官均对 PEPC的活性造成了影响［14～16］。而有关PEPC含量在这方面的报道则相对较少，但同源性较高的PEPC基因在不同植物体内表达也是有差异的，甚至同种植物的不同发育阶段，PEPC的含量也差异较大［4～16］，在箭竹属中，因自然分布环境的不同，对不同竹种成熟叶片中PEPC含量造成了显著影响。

针对竹类植物，由于目前没有一个明确的PEPC含量评定标准。尽管不同属之间差异显著，但同一属之间不同竹种也差异特别显著，而并不一致，例如箭竹属中元江箭竹PEPC含量远低于另外2个竹种，这种差异可能是由于元江箭竹自然分布于干热河谷地带而造成的遗传差异。因此，PEPC含量受环境因子的影响巨大，也不能作为竹类植物，尤其不同属、不同种之间系统分类的评定指标。竹类植物在高温、高湿的温室环境下，PEPC含量反而比温室外的低，不同栽培环境和发育阶段的同种竹子中PEPC含量也存在显著差异，因此，推测竹类植物应属于C3植物，PEPC含量的变化与光合作用碳同化的途径之间没有相关性。

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