箭竹DNA导入水稻后其遗传背景、农艺性状及产量分析

刘华 梁发茂 张德建 徐俊英 李志新

摘要：【目的】將箭竹DNA导入水稻，并分析其遗传背景、农艺性状及产量，为水稻遗传育种提供技术参考。【方法】利用花粉管通道技术将箭竹DNA导入4个水稻恢复系受体材料（9311、华占、Q7和扬恢22）中，筛选出表型与受体材料存在差异的株系连续自交直至稳定，并利用筛选出的49对多态性SSR引物鉴定变异株系的遗传背景差异。以不同遗传背景的变异株系与不育系3S和6303S配制杂交组合，并比较分析其农艺性状差异。【结果】将箭竹DNA导入水稻后通过连续自交筛选出能稳定遗传的变异株系21个（T1～T21），其中9311、华占、Q7和扬恢22的变异率分别为4.85%、1.30%、2.35%和2.65%。利用SSR标记分析变异株系的遗传背景，发现其与受体材料在49对SSR标记在中存在差异的引物对数为2～24对，其中在24对标准引物中存在差异的对数范围为0～11对，表明通过花粉管通道技术产生的变异具有一定的随机性。不同遗传背景变异株系与不育系组配的杂交组合在农艺性状和产量方面存在明显差异，从中筛选出2个优势组合6303S×T10和6303S×T20，分别比我国长江中下游中籼迟熟组筛选试验对照品种丰两优4号增产10.9%和12.9%。【结论】将箭竹DNA导入水稻可产生稳定遗传的变异株系，从而获得与其组配的优势杂交组合，即通过花粉管通道技术导入外源DNA或基因是水稻种质资源创新及新品种选育的有效途径。

关键词： 水稻；箭竹；花粉管通道技术；SSR标记；农艺性状；产量

中图分类号： S511.035.3 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）04-0619-09

Genetic backgroud， agronomic traits and yield of rice after introgression of Fargesia spathacea Franch.

LIU Hua1， LIANG Fa-mao2， ZHANG De-jian3， XU Jun-ying1*， LI Zhi-xin1*

（1College of Agronomy， Yangtze University/Hubei Collaborative Innovation Center for Crop Industry， Jingzhou，Hubei 434025， China； 2Yichang Academy of Agricultural Science， Yichang， Hubei 443004， China； 3Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Abstract：【Objective】DNA of Fargesia spathacea Franch. were introgressed into rice by pollen-tube pathway， then genetic background， agronomic traits and yield of rice were analyzed to provide reference for rice genetics and breeding. 【Method】DNA of F. spathacea were introgressed into four rice varieties（9311，Huazhan，Q7 and Yanghui 22） by pollen-tube pathway. The lines whose phenotypes were different from receptor materials were selected to self-breed till they were stable. Then genetic background differences between variant lines and receptor materials were identified by the screened 49 pairs of SSR markers. Cross combinations were established by variant lines with different genetic background and two sterile lines（3S and 6303S）， and their differences in agronomic traits were analyzed. 【Result】The results showed that after DNA of F. spathacea were introgressed into rice receptor materials and let them self-bred， 21 variant lines（T1-T21） that could transmit stably were obtained. Among them， variations of 9311， Huazhan， Q7 and Yanghui 22 were 4.85%， 1.30%， 2.35% and 2.65% respectively. Genetic background of the variant lines were analyzed by SSR markers. Among the 49 pairs of SSR markers， the variant lines were different from the receptor materials in 2-24 pairs of SSR markers； and among 24 pairs of standard primers， there were differences in 0-11 pairs. The results showed variation brought by po-llen-tube pathway was random. The hybrid combinations by variant lines with various genetic backgrounds and sterile lines had various agronomic traits and yields. Two advantage hybrid combinations， 6303S×T10 and 6303S×T20， from the cross combinations were selected. The yields of 6303S×T10 and 6303S×T20 increased by 10.9% and 12.9% than Fengliangyou 4， a control variety selected from middle-season late-mature indica rice combinations in the middle and lower reaches of Yangtze River. 【Conclusion】Introgression of DNA of F. spathacea into rice can obtain variant lines with stable heredity， then obtain advantage hybrid combinations that crosses with them. Introgression of exogenous gene by po-llen-tube pathway is an effective way in rice gerplasm resources innovation and variety breeding.

Key words： rice； Fargesia spathacea Franch.； pollen-tube pathway technique； SSR marker； agronomic traits； yield

0 引言

【研究意义】水稻（Oryza sativa L.）是我国最重要的粮食作物之一。矮杆水稻和杂交水稻品种的相继推广应用使水稻产量大幅度提高。近年来，由于水稻亲本间遗传背景差异日益减小，难以选配出强优势杂交组合，因此，我国水稻育种和生产面临巨大挑战。结合现代生物技术创新水稻种质资源以提高亲本的遗传多样性，是选育出高产、优质新品种的关键。其中，花粉管通道技术是一种可应用于任何开花植物的基因或基因组转化技术，不受基因型限制，能将供体材料的基因或基因组直接导入受体材料，并与其基因组进行整合，致使受体材料产生变异（Zhou et al.，1983），不仅后代遗传性状稳定，还可避免常规转基因方法带来的安全性争议问题，易于实现基因或基因组的大规模转化，是创造新种质和拓宽基因库的有利途径。箭竹（Fargesia spathacea Franch.）隶属于禾本科箭竹属，具有耐旱、耐寒、抗虫、抗倒伏、根系发达和再生力强等特性，通过花粉管通道技术将其DNA快速导入水稻，使水稻产生相关变异，对创新水稻种质及遗传育种具有重要意义。【前人研究进展】自1983年Zhou等建立花粉管通道技术以来，该技术已被广泛应用于开花植物的种质创新及遗传育种等研究，其基本原理是利用授粉经伸长的花粉管将外源DNA或基因沿珠心通道导入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞（周光宇等，1988）。Luo和Wu（1989）首次利用花粉管通道技术将含报告基因的质粒转入水稻，经Southern杂交和酶学鉴定，获得外源基因整合并表达的转基因水稻植株。王丰等（2004）通过花粉管导入法将稗草和玉米DNA导入水稻中，获得稳定的变异株系。王永斌等（2011）、肇莹等（2015）将玉米和芦苇的DNA通过花粉管通道法导入不同水稻品种受体，在转化后代中筛选获得光合效率、穗长、每穗粒数、千粒重和抗盐性均提高的变异株系。孙一丹等（2013）通过与花粉管通道技术同样基于基因组“片段杂交”原理的穗茎注射技术，将小粒野生稻DNA导入水稻保持系V20B中，获得株型和产量等方面均发生明显变异的株系。除水稻外，通过花粉管通道技术还可将外源物种的DNA成功导入小麦、棉花和玉米等农作物中，并获得理想的变异材料（倪建福等，2005；刘冬梅等，2007；高树仁等，2016）。此外，还有利用花粉管通道技术转化外源基因组创新林木种质资源的研究报道（陈洪伟，2008；赵鑫闻，2016）。以上研究证实，花粉管通道技术与远缘杂交相比，有效克服远缘杂交不亲的难题，且成功率高、耗时少、稳定快；与其他转基因方法相比，不依赖组织培养技术，操作简单，成本低廉，安全性好，易推广应用。【本研究切入点】至今，鲜见利用花粉管通道技术将箭竹DNA快速导入水稻的相关研究报道。【拟解决的关键问题】利用花粉管通道技术将箭竹DNA导入4个广泛应用于生产的水稻恢复系（9311、华占、Q7和扬恢22），从而获得稳定遗传的变异株系，对其遗传背景和农艺性状进行分析，并与不育系3S和6303S组配杂交组合，分析其农艺性状和产量，以期获得优势杂交组合，为水稻种质资源创新及遗传育种提供技术支持。

1 材料和方法

1. 1 试验材料

供体材料为箭竹，采自湖北十堰神农架海拔2000 m左右的高山，抗性强，适应性广。受体材料为4个广泛应用于生产的水稻恢复系，其中，9311、华占和扬恢22由湖北省农业科学院粮食作物研究所提供，Q7由湖北省种子集团有限公司提供。不育系3S和6303S分别由长江大学农学院和湖北荃银高科种业有限公司提供，用于与受体恢复系及其变异株系配制两系杂交组合，以期筛选出强优势杂交后代。丰两优4号由合肥丰乐种业有限公司提供。PCR扩增及凝胶电泳所需的试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要仪器设备：PCR仪（Bio-Rad T100）、离心机（eppendorf 5810R）、电泳仪（JY 5000）和电泳槽（JY-JX5）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 箭竹和水稻DNA提取 取箭竹和水稻新鲜叶片60 mg，用液氮研磨成粉末，加入20 mL预热的提取液[2% CTAB、0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）、0.02 mol/L Na2EDTA、1.4 mol/L NaCl和0.2%巯基乙醇]，65 ℃水浴30 min，期间颠倒数次后加入20 mL氯仿和异戊醇（24∶1），温和颠倒混匀10 min，静置5 min，4 ℃下8000 r/min离心10 min，取10 mL上清液加入等体积的氯仿和异戊醇（24∶1）再抽提1次，取1 mL上清液加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20 ℃放置30 min，4 ℃下10000 r/min离心5 min，弃上清液，用75%乙醇洗涤沉淀2次，凉干后用ddH2O溶解，DNA（OD260/OD280为1.8～2.0）稀释至100 μg/mL，-20 ℃保存备用。

1. 2. 2 箭竹DNA转化 转化时间为水稻开花后1.5～3.0 h。除去水稻穗上已开和未开颖花，用镊子将水稻当天开放颖花的内外颖分开，刀片切掉柱头（不伤及子房），用移液枪向切口处滴入10.00 μL箭竹DNA（100 μg/mL），合上颖壳，套袋隔离，收获成熟的种子。以ddH2O转化水稻作为对照。

1. 2. 3 变异株系筛选 变异株系筛选试验在湖北省荆州市和海南省陵水县光坡镇进行，一年筛选两代。对收获的种子进行田间种植观察，抽穗期进行套袋自交，每株收取主穗。下一世代各种植50株（10株/行，共5行），株行距为16.6 cm×20.0 cm。以受體亲本为对照，考查各转化株系的播始历期、分蘖数、株高、粒型、穗粒数、千粒重和结实率等农艺性状，筛选出变异株系。连续种植变异株系（10株/行，共3行），株行距为16.6 cm×20.0 cm，从苗期开始考查其主要农艺性状，开花期单株套袋自交，成熟期考查产量性状，选择变异单株连续自交，直至性状稳定。

1. 2. 4 SSR标记分析

1. 2. 4. 1 引物筛选及合成 从国家水稻数据中心（http：//www.ricedata.cn/marker/index.htm）获取84对平均分布在12个连锁群上的SSR引物序列，对变异株系和4个受体材料进行遗传背景分析，从中筛选出49对具有多态性的SSR引物（表1），其中24对为构建DNA指纹图谱的标准引物。所有引物序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2. 4. 2 PCR扩增SSR标记 PCR反应体系15.00 μL：10×Buffer（含Mg2+）1.50 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.45 μL，2 mmol/L dNTPs 0.75 μL，Taq DNA聚合酶0.35 μL，10 ng/μL DNA模板2.00 μL，ddH2O补足至15.00 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 45 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，进行36个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后，反应体系中加入1.00 μL溴酚蓝，混匀，用7%聚丙烯凝胶电泳检测扩增片段的多态性，分析变异株系与受体材料的遗传背景。

1. 2. 4. 3 农艺性状及产量分析 从不同遗传背景变异株系中挑选田间表现较好的株系各2份，按不完全双列杂交设计，分别与不育系3S和6303S配制杂交组合，试验在长江大学农学院基地进行。采用随机区组设计，3次重复。5月1日播种，薄膜覆盖育苗，6月2日移栽，单本植，株行距为16.6 cm×20.0 cm，每小区种植30株（10株/行，共3行），大田常规管理。抽穗时调查始穗期，成熟时取各小区中间行连续6株长势基本相同的单株进行考种，测定其株高、单株有效穗数、单穗长、每穗总粒数、每穗实粒数、结实率和千粒重等性状。各小区分别混收测产，产量为考种植株产量在内的30株水稻产量之和。由于丰两优4号为长江中下游地区水稻中籼迟熟组的对照品种，在品种筛选及审定过程中均以其为标准对照，因此本研究也以其产量与各组合的产量进行比较分析。

1. 3 统计分析

采用SPSS 19.0进行各性状间的相关分析。

2 结果与分析

2. 1 变异株系筛选结果

水稻开花后1.5～3.0 h，将箭竹DNA导入4个受体材料共1095朵颖花中，收获839粒种子，成粒率为76.60%，田间种植成苗数为792株，成苗率为94.39%（表2）。在苗期和成熟期进行主要农艺性状考察及测定，结果筛选出42个在播始历期、分蘖数、株高、穗粒数、干粒重、粒型和结实率等性状上发生变异的单株，平均转化率为5.30%。通过连续自交筛选出能稳定遗传的变异株系21个（T1～T21），其中9311、华占、Q7和扬恢22的变异率分别为4.85%、1.30%、2.35%和2.65%（表2）。

2. 2 SSR标记的遗传背景差异分析结果

利用49对多态性SSR引物对筛选出的21个变异株系和4个受体材料进行遗传背景差异分析，结果如表3所示。变异株系与受体材料存在差异的引物对数为2～24对，其中在24对标准引物中存在差异的对数为0～11对，表明变异株系与受体材料具有不同的遗传背景，而相同受体材料产生的不同变异株系间的遗传背景也存在一定差异。可见，通过花粉管通道技术产生的变异具有一定的随机性。根据水稻品种鉴定标准（NYT 1433—2007），当检测到待测品种在24对标准引物中存在2对及以上差异时即可判定为不同品种。在21个变异株系中有13个可与受体材料完全区分开，另外8个变异株系也能在其他位点上找到与受体材料的差异，其中，以9311为遗传背景的变异株系有8个（T1～T8），以华占为遗传背景的变异株系有3个（T9～T11），以Q7为遗传背景的变异株系有4个（T12～T15），以扬恢22为遗传背景的变异株系有6个（T16～T21）。由此进一步证实，田间筛选获得的21个农艺性状稳定变异株系在遗传上也存在明显变异。

由表4可知，利用49对多态性SSR引物从21个变异株系中共检测出135个等位变异位点，每对引物检测出的等位变异数为2～5个，其中检测出等位变异数目最多的是RM232和RM304，均为5个，平均每对引物的变异位点为2.90个，表明21个变异株系的变异位点丰富且随机。部分引物RM35、RM258、RM208和RM297凝胶电泳结果如图1所示。虽然21个变异株系在遗传上与其受体材料均存在差异，但从应用价值角度筛选出田间表现较好的8个变异株系，包括以9311为遗传背景的变异株系T1和T2，以华占为遗传背景的变异株系T9和T10，以Q7为遗传背景的变异株系T14和T15，以扬恢22为遗传背景的变异株系T20和T21。按不完全双列杂交设计，与不育系3S和6303S配制杂交组合，以期筛选出强优势杂交组合供生产应用。但组合3S×Q7、3S×T20、3S×T21、3S×扬恢22、3S×T20和3S×T21因感光性太强，未能正常抽穗。

2. 3 9311遗传背景变异株系及其与不育系组配杂交组合的农艺性状及产量分析结果

由表5可知，变异株系T1的播始历期和株高显著低于受体材料9311（P<0.05，下同），但千粒重显著增加，单穗长、单株有效穗数、每穗总粒数和结实率无显著差异（P>0.05，下同）；变异株系T2的单株有效穗数和每穗粒数均显著高于受体材料9311，但单穗长显著降低，播始历期、株高、结实率和千粒重无显著差异。综上所述，变异株系T2的单株有效穗数和每穗总粒数为有利变异，具有较大的应用潜力。

变异株系T1和T2分别与不育系3S和6303S组配杂交组合的农艺性状如表5所示。组合3S×T1的播始历期、株高、结实率和千粒重较受体组合3S×9311显著降低，但单株有效穗数显著增加，其他性状无显著差异；组合3S×T2的播始历期、每穗总粒数和结实率较受体组合3S×9311均显著降低，单株有效穗数和千粒重均显著增加，其他性状无显著差异。组合6303S×T1的每穗总粒数和千粒重较受体组合6303S×9311显著降低，其他性状无显著差异；组合6303S×T2的单穗长、单株有效穗数、每穗总粒数和千粒重较受体组合6303S×9311显著降低，其他性状无显著差异。在变异株系与不育系组配的4个组合中，以组合3S×T1产量表现最优，较受体组合3S×9311显著增产21.5%，较丰两优4号（11476.6 kg/ha）增產3.2%，该组合的优势在于具有较高的单株有效穗数。综上所述，虽然变异株系T1的千粒重较受体材料9311显著增加，变异株系T2的单株有效穗数和每穗总粒数较9311也显著增加，但与其组配的组合在相应性状上未表现出优势，其原因是杂种组合性状表现受父母本间特殊配合力的影响，后期可根据特殊配合力分析结果进行组配，仍有望筛选出强优势组合。

2. 4 华占遗传背景变异株系及其与不育系组配杂交组合的农艺性状及产量分析结果

由表6可知，变异株系T9的每穗总粒数和千粒重均显著高于受体材料华占，而其他性状无显著差异。变异株系T9与受体材料华占的穗型比较见图2，可看出变异株系T9的每穗总粒数明显多于华占。变异株系T10的播始历期较受体材料华占显著降低，单株有效穗数和千粒重显著增加，其他性状无显著差异。综上所述，变异株系T9的每穗总粒数和千粒重及变异株系T10的单株有效穗数和千粒重均为有利变异，具有较大的应用潜力。

变异株系与不育系3S和6303S配制杂交组合的农艺性状如表6所示。组合3S×T9的单株有效穗数较受体组合3S×华占显著减少，千粒重显著增加，其他性状无显著差异；组合3S×T10的株高较受体组合3S×华占显著降低，千粒重和单株有效穗数显著增加，其他性状无显著差异。组合6303S×T9的单株有效穗数较受体组合6303S×华占显著减少，但千粒重显著增加，其他性状无显著差异；组合6303S×T10的播始历期、株高、每穗总粒数和千粒重较受体组合6303S×华占显著增加，单株有效穗数显著降低。在变异株系与不育系组配的4个组合中，以组合6303S×T10产量表现最优，较受体组合6303S×华占显著增产10.8%，较丰两优4号增产10.9%，可作为新优势组合进一步筛选。

2. 5 Q7遗传背景变异株系及其与不育系组配杂交组合的农艺性状及产量分析结果

由表7可知，变异株系T14的播始历期、株高和单株有效穗数较受体材料Q7显著增加，其他性状均无显著差异；变异株系T15的播始历期和株高较受体材料Q7显著增加，但单株有效穗数和每穗总粒数显著减少。可见，变异株系T14仅在单株有效穗数上較受体材料Q7有所改良，为有利变异，而变异株系T15的单株有效穗数和每穗总粒数均较受体材料Q7差。

变异株系与不育系6303S配制杂交组合的农艺性状如表7所示。组合6303S×T14的播始历期、株高、单穗长、结实率和千粒重较受体组合6303S×Q7显著增加，但单株有效穗数显著减少；组合6303S×T15的株高、结实率和千粒重较受体组合6303S×Q7显著增加，而每穗总粒数和有效穗数显著减少。在变异株系与不育系组配的2个组合中，以组合6303S×T14产量表现最优，较受体组合6303S×Q7显著增产20.9%，但较丰两优4号减产20.0%，应予以淘汰。

2. 6 扬恢22遗传背景变异株系及与不育系组配杂交组合的农艺性状及产量分析结果

由表8可看出，变异株系T20和T21的播始历期较扬恢22显著减少，但单株有效穗数、单穗长、每穗总粒数和千粒重均显著增加，表明两个变异株系的主要产量构成性状均显著提升。

变异株系T20和T21与不育系6303S配制杂交组合的农艺性状如表8所示。组合6303S×T20和6303S×T21较受体组合6303S×扬恢22的播始历期显著减少，株高和千粒重显著增加。其中，组合6303S×T20的单株有效穗数较受体组合6303S×扬恢22显著增加，组合6303S×T21的每穗总粒数较受体组合6303S×扬恢22显著增加。在变异株系与不育系组配的2个组合中，以组合6303S×T20产量表现最优，较受体组合6303S×扬恢22显著增产45.7%，较丰两优4号增产12.9%，可作为新优势组合进一步筛选。

3 讨论

花粉管通道技术作为一种简单有效的外源DNA导入方法，现已广泛应用于水稻（王丰等，2004）、小麦（倪建福等，2005）、棉花（刘冬梅等，2007）、玉米（董春林等，2011）及林木（赵鑫闻，2016）的研究领域。花粉管通道技术的转化率与转化时间密切相关，最佳的转化时期是受精初期，外源DNA通过花粉管进入胚囊（周光宇等，1988）。但不同植物的最佳转化时间存在差异，王丰等（2004）在水稻授粉后的1.5～2.0 h进行转化，变异率可达1.48%～3.80%；丁建庭等（2009）研究发现，水稻授粉后0.5～2.5 h是最佳转化时间；周岩等（2011）研究发现，小麦最佳转化时期是开花后1.0～1.5 h。本研究于水稻授粉后的1.5～3.0 h进行转化，变异率为1.30%～4.85%，与上述的研究结果基本一致。

将外源DNA或基因导入受体材料中具有诱变和基因转移双重作用。本研究利用花粉管通道技术将箭竹DNA导入水稻是由于二者均属于禾本科植物，具有一定的亲缘关系，在部分染色体区域可能发生交换与重组。通过SSR标记分析，发现受体材料与变异株系间存在遗传背景差异，说明外源DNA导入可改变受体材料的遗传背景。因此，通过外源DNA导入不仅能为遗传学研究提供特异材料，还可为育种创造有利的变异材料。唐清杰等（2010）将海南疣粒野生稻基因导入栽培稻中，获得单穗长、产量和抗性均较优的变异材料；王永斌等（2011）将玉米DNA导入水稻中获得高光效的变异材料；魏霞等（2015）将高梁DNA导入水稻获得抗旱性较强的变异材料；贾影影等（2016）将大豆DNA导入小麦中，获得产量和品质均较优的变异材料。本研究发现，将箭竹DNA导入4个水稻恢复系受体材料中，获得的变异株系保留了受体材料的主要特性，但单株有效穗数、每穗总粒数、穗长和千粒重等性状存在明显差异，且变异株系与不育系组配的组合在农艺性状和产量方面与受体组合也存在明显差异，其中有2个优势组合6303S×T10和6303S×T20较我国长江中下游中籼迟熟组筛选试验对照品种丰两优4号增产10.0%以上，可作为新优势组合进一步筛选。

利用花粉管通道技术导入外源DNA可产生稳定遗传的有利变异，是物种种质资源创新的有效途径。但本研究发现，利用花粉管通道技术导入外源DNA产生变异具有一定的随机性，可重复性较低，且产生变异的分子机理尚不明确，可能是尚未被广泛接受的主要原因。但随着该技术的发展和应用及其产生变异的分子机理研究不断深入，将会被广泛应用于各研究领域。

4 结论

将箭竹DNA导入水稻可产生稳定遗传的变异株系，从而获得与其组配的优势杂交组合，即通过花粉管通道技术导入外源DNA或基因是水稻种质资源创新及新品种选育的有效途径。

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（责任编辑 陈 燕）