天然产物增强阿霉素抗乳腺癌作用的体外筛选

刘雯清，张璐璐，刘毅清，顾文文，颜天华，姜远英，曹永兵，＊（.福建中医药大学药学院，福州 5008；.第二军医大学药学院，上海 00；.第二军医大学训练部，上海 00；.中国药科大学药学院，南京 0009）

·药理·

天然产物增强阿霉素抗乳腺癌作用的体外筛选

刘雯清1，张璐璐2，刘毅清3，顾文文4，颜天华4，姜远英2，曹永兵1，2＊（1.福建中医药大学药学院，福州 350108；2.第二军医大学药学院，上海 200433；3.第二军医大学训练部，上海 200433；4.中国药科大学药学院，南京 210009）

目的 从植物天然产物中筛选具有增强阿霉素抗乳腺癌细胞增殖作用的活性化合物，并对两药联合后的体外抗肿瘤活性进行初步评价。方法 采用MTT法研究15种单体化合物对人乳腺癌细胞MDA－MB－231的影响。结果 小檗碱、松萝酸、鱼腥草素钠、槲皮素在50μg·mL－1时对MDA－MB－231细胞的抑制率分别为72%（P＜0.001），74%（P＜0.001），91%（P＜0.001）和59%（P＜0.01），且具有剂量依赖性。联合用药结果显示，小檗碱与阿霉素联用，CI值小于1。结论 小檗碱、松萝酸、鱼腥草素钠、槲皮素对MDA－MB－231细胞的增殖活性具有抑制作用，同时，小檗碱与阿霉素联用具有协同抗肿瘤作用。

天然产物；阿霉素；抗乳腺癌；联合用药；药物筛选；MDA－MB－231；小檗碱

现有抗肿瘤药物由于其具有较强的毒性和耐药性，使其应用受到极大限制。近年来，越来越多的天然产物被证实具有抗肿瘤活性，能够通过影响p53、PI3K／Akt／mTOR等肿瘤相关信号通路抑制肿瘤细胞增殖，与化疗药物联用能够发挥增效减毒的功效［12］。因此，探究耐药机制及寻找新型分子靶向抗肿瘤药物的同时，发现新的两药或多药联合针对多靶点的协同治疗手段受到广泛关注。本文对15种植物单体进行抗肿瘤活性的体外筛选，发现小檗碱、松萝酸、鱼腥草素钠、槲皮素4种天然产物对乳腺癌细胞MDA－MB－231具有不同程度的抑制作用，其中小檗碱与阿霉素联用显示协同抗肿瘤作用，为后续治疗乳腺癌联合用药的研究奠定了基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 CO2培养箱（Forma Scientific公司）；超净工作台（苏净集团安泰公司）；CKX41倒置显微镜（Olympus公司）；微量加样器（Eppendorf公司）；HWS24型电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）；MTS酶标板振荡器（IKA公司）；TDL80－2B飞鸽牌离心机（上海安亭科学仪器厂）；XW－80A涡旋混合器（上海医科大学仪器厂）；INFINITE 200酶标仪（瑞士Tecan公司）。

1.2 试药 盐酸多柔比星（doxorubicin）、二甲基亚砜（DMSO）、噻唑蓝（MTT），Sigma公司；DMEM高糖培养基、胰蛋白酶（trypsin－EDTA（1X）2.5g·L－1trypsin）、青霉素－链霉素（penicillin－streptomycin），Invitrogen公司；胎牛血清（FBS），Hyclone公司；cell counting Kit－8（CCK－8），碧云天生物技术研究所；PBS、MTT工作液（5mg·mL－1），自制。阿魏酸、绿原酸、苦豆碱、柚皮苷、橙皮苷、木犀草素、氧化苦参碱、绞股蓝皂苷、小檗碱、芹菜素、芦丁、槲皮素、鱼腥草素钠、水飞蓟素和松萝酸，均由上海融禾制药科技有限公司提供（质量分数均大于98%）。

1.3 细胞 MDA－MB－231细胞（中科院上海药物所丁健院士赠送）。

2 实验方法

2.1 MDA－MB－231细胞生长曲线的测定 消化收集对数生长期细胞，计数调整细胞浓度，接种3×104个细胞／孔于12孔酶标板中，调零孔中只加培养基，每组3个复孔，并以MTT比色法连续测定7d（24，48，72，96，120，144和168h），考察细胞生长增殖状态，并绘制生长曲线。MTT测定方法：轻轻吸除旧培液并加入新鲜培养基1mL／孔，加入MTT工作液100μL／孔，置于培养箱中继续培养。4h后取出培养板，轻轻吸除培养基，加入1.5mL／孔DMSO，于平板振荡仪上以300r·min－1震荡10min，酶标仪测定吸光度值（参比波长630nm，测定波长570nm）［3－6］。

2.2 MTT法检测药物对MDA－MB－231抑制作用时细胞接种密度的摸索 常规消化收集对数生长期细胞，计数调整细胞浓度，分别接种1×103，2×103，4 ×103，8×103个细胞／孔于96孔酶标板中，每孔培养液体积200μL，调零孔中只加培养基，每组3个复孔。分别培养48h后，MTT法考察细胞相对数量。MTT测定方法：加入5mg·mL－1MTT工作液20 μL／孔，置于培养箱中继续培养。4h后取出培养板，轻轻吸除培养基后加入150μL／孔DMSO，于平板振荡仪上以600r·min－1震荡10min，酶标仪测定吸光度值（参比波长630nm，测定波长570nm），并以吸光度值的大小比较细胞相对数量，A值一般在0.8～1.5较为合适［7］。

2.3 WST－8法检测化合物对MDA－MB－231细胞增殖的影响 将实验所需处于对数生长期的MDAMB－231细胞按4 000个细胞／孔的密度接种于96孔酶标板内，每孔内体积为100μL。置于孵箱内培养24h后，加入含终质量浓度为50mg·mL－1化合物的培液（每孔体积为100μL）作用，设置调零组与对照组。继续置于孵箱内培养一段时间（48h）后，轻轻吸除含药培液，加入100μL／孔新鲜培液，每孔加入10μL CCK－8溶液。继续孵育3h后放于酶标仪上检测（检测波长为450nm，参比波长为650nm）。将检测后的吸光度值整理后按下式计算化合物对细胞的生长抑制率。

2.4 MTT法检测天然产物与阿霉素固定比例联用对MDA－MB－231细胞增殖的影响 将实验所需处于对数生长期的MDA－MB－231细胞按4 000个细胞／孔的密度接种于96孔酶标板内，每孔内体积为100μL。化合物与DOX按固定比例预混合，2倍比梯度稀释，设8个质量浓度，每个质量浓度3复孔，并设置调零组与空白对照组。细胞贴壁24h后，加入含药培养基100μL／孔，96孔板外圈填充PBS。药物作用48h后，轻轻吸尽含药培养基，加入新鲜培液100μL／孔，再加入10μL／孔MTT工作液（5 mg·mL－1），37℃孵育4h。取出96孔酶标板，吸尽培养基，加入150μL／孔DMSO，于平板振荡器上震荡10min，充分溶解甲瓒，以630nm为参比波长，570nm处测定A值。计算细胞增殖抑制率，并用SPSS 17.0Logit回归考查量效曲线拟合度，计算IC50值及两药联合指数CI。A、B两药联合指数CI的计算及评价方法：CI＝A联用IC50／A单用IC50＋B联用IC50／B单用IC50，CI＜1协同，CI＝1相加，CI＞1无关或拮抗［8－11］。

2.5 数据处理 实验结果数据用x±s表示，2组独立样本均数之间的比较用单因素方差分析进行统计，检验结果P＜0.05则被认为均数间差异具有统计学意义。所有数据均采用SPSS17.0软件进行处理。

3 实验结果

3.1 MDA－MB－231细胞生长曲线 随着培养时间的延长，MTT检测到MDA－MB－231细胞的A值逐渐升高。MDA－MB－231细胞在第1～4d处于对数生长期，第6～7d处于生长平台期。见图1。由MTT结果可知，MDA－MB－231细胞的药物敏感性实验宜在2～4d内进行（对数生长期）。

图1 MDA－MB－231细胞生长曲线Fig.1 Cell growth curve of MDA－MB－231

3.2 MDA－MB－231细胞接种的摸索 结果见表1。随着MDA－MB－231细胞接种密度的升高、培养时间的延长，吸光度值A会随之增大。接种细胞数为4× 103～8×103个／孔培养48h后，或2×103～4×103个／孔培养72h后，或1×103个／孔培养96h后，较适用于细胞毒性实验检测肿瘤细胞药物敏感性。

表1 MDA－MB－231细胞接种浓度与吸光度A值及培养时间的关系Tab.1 Relationship between the MDA－MB－231cell concentration，Aand incubating time ±s）

表1 MDA－MB－231细胞接种浓度与吸光度A值及培养时间的关系Tab.1 Relationship between the MDA－MB－231cell concentration，Aand incubating time ±s）

培养时间／h每孔接种不同细胞数A值8×103 4×103 2×103 1×10348 1.15±0.01 0.67±0.01 0.37±0.01 0.18±0.00 72 2.22±0.20 1.13±0.12 0.83±0.02 0.51±0.03 96 2.75±0.09 2.84±0.09 2.30±0.03 1.37±0.03

3.3 WST－8比色法检测化合物对MDA－MB－231细胞增殖的影响 本实验考察天然产物质量浓度为50 μg·mL－1时对MDA－MB－231细胞增殖的抑制率。结果见表2。15种天然产物中，小檗碱、松萝酸、鱼腥草素钠、槲皮素对MDA－MB－231细胞有不同程度的杀伤作用（抑制率＞55%）。细胞增殖抑制率分别为72%（P＜0.001），74%（P＜0.001），91%（P＜0.001）和59%（P＜0.01）。

表2 15种化合物对MDA－MB－231细胞的抗增殖作用活性Tab.2 Cytotoxicity effect of 15natural products on MDA－MB－231cell proliferation ±s）

表2 15种化合物对MDA－MB－231细胞的抗增殖作用活性Tab.2 Cytotoxicity effect of 15natural products on MDA－MB－231cell proliferation ±s）

编号 天然产物（50μg·mL－1） 抑制率／%1小檗碱0.72±0.01 2阿魏酸 0.00±0.08 3绿原酸 －0.02±0.09 4苦豆碱 －0.01±0.02 5松萝酸 0.74±0.02 6鱼腥草素钠 0.91±0.03 7槲皮素 0.59±0.12 8芦丁 －0.02±0.13 9芹菜素 0.50±0.02 10 氧化苦参碱 0.07±0.09 11 柚皮苷 －0.14±0.15 12 水飞蓟素 0.32±0.08 13 橙皮苷 －0.14±0.07 14 木犀草素 0.55±0.03 15 绞股蓝皂苷0.03±0.03

3.4 候选化合物对MDA－MB－231细胞毒性作用的量效关系 对筛出的4种化合物（小檗碱、松萝酸、鱼腥草素钠、槲皮素）进行量效关系的实验考察，MTT结果显示，4种候选化合物在50，25，12.5，6.25，3.125和1.562 5μg·mL－1的质量浓度下，随着化合物剂量增加，A逐渐降低，MDA－MB－231活细胞数量逐渐减少，并呈现一定的剂量依赖性，尤其是小檗碱和松萝酸的剂量依赖性较好，在质量浓度降低后仍有较强的肿瘤细胞抑制作用。见图2。

3.5 天然产物与阿霉素联用对MDA－MB－231细胞增殖的影响 选取2.4实验中抑制率剂量依赖性最好的小檗碱和松萝酸进行联合用药实验，考察其对MDA－MB－231细胞增殖的影响。结果见表3。结果显示，小檗碱在特定联合用药剂量比例下与阿霉素联用，较单独用药时，能够显著降低阿霉素的IC50值，而松萝酸却无此作用。分别计算这2种天然产物与阿霉素的联合用药指数CI值，评价两药相互作用模式，得出小檗碱在预设的3种剂量比例下与阿霉素联用均能对阿霉素抗乳腺癌细胞MDA－MB－231发挥协同增效作用。

图2 4种候选化合物对MDA－MB－231细胞毒性作用的量效关系A.小檗碱；B.松萝酸；C.鱼腥草素钠；D.槲皮素Fig.2 Effect of 4natural products on cell viability inhibition of human breast cancer cell line MDA－MB－231A.berberine；B.usnic acid；C.sodium houttuyfonate；D.quercetin

表3 候选化合物联合阿霉素对MDA－MB－231细胞的抗增殖作用Tab.3 Effect of 2compounds combined with DOX on MDAMB－231cell viability inhibition treated for 48h

4 讨论

蒽环类抗生素是乳腺癌早期化疗中的主要用药，其中阿霉素是乳腺癌临床化疗联合用药最常用的代表药物，广泛用于治疗实体瘤和血液肿瘤［12］。

然而，由于阿霉素易导致各类严重的器官毒性和全身毒性问题，尤其是剂量依赖的阿霉素性心肌病及各类胃肠道不良反应等，使其临床应用受到极大限制［13］。近年来研究表明，化疗药物与天然药物联合应用往往能起到增效减毒的抗肿瘤活性［14－15］，因此，我们希望从天然产物中寻找联合阿霉素具有增强抗肿瘤效应的化合物，通过降低阿霉素剂量，或者缓解其对正常器官的毒性，从而达到更有效治疗乳腺癌的目的。

本文选取15种天然产物单体成分，用CCK8法及MTT法检测药物对细胞增殖的影响，初步考察了其抗乳腺癌活性及其剂量－效应关系，并且联合阿霉素后评价其增效作用。我们首先对筛选工具细胞的增殖情况及药物敏感性实验方法学进行了初步考察，后对所选化合物进行一定剂量下的细胞毒性测定，发现4种天然产物单用时对乳腺癌MDA－MB－231细胞具有一定程度的抑制作用，且小檗碱和松萝酸在低剂量下也具有抗肿瘤活性。随后将小檗碱和松萝酸分别与阿霉素在一定比例下联合用药，考察其协同增效作用。小檗碱在预设的联合用药剂量比例下与阿霉素联用具有协同抗乳腺癌的作用，因此，我们考虑选取最佳候选化合物小檗碱用于后续研究，深入探索其联合阿霉素在抗乳腺癌中的应用。

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Screening of natural products enhancing doxorubicin′s anti－breast cancer effect in vitro

LIU Wenqing1，ZHANG Lulu2，LIU Yiqing3，GU Wenwen4，YAN Tianhua4，JIANG Yuanying2，CAO Yongbing1，2＊（1.School of Pharmacy，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350108，China；2.School of Pharmacy，the Second Military Medical University，Shanghai 200433，China；3.Training Department，the Second Military Medical University，Shanghai 200433，China；4.School of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China）

Objective To screen the active anti－tumor compounds from natural herb products and make a preliminary assessment on the anti－tumor activities of their combination with doxorubicin in vitro.Methods MTT method was used to test 15monomeric compounds′anti－tumor effects on breast cancer cells MDA－MB－231 in vitro.Results The inhibition rates of berberine，usnic acid，sodium houttuyfonate and quercetin on MDA－MB－231cells were 72%（P＜0.001），74%（P＜0.001），91%（P＜0.001）and 59%（P＜0.01）at 50μg·mL－1in a dose－dependent manner.Drug combination results showed that CI values of berberine combined with doxorubicin was less than 1.Conclusion Berberine，usnic acid，sodium houttuyfonate and quercetin inhibited the proliferation of MDA－MB－231cells.Drug combination results showed that berberine combined with doxorubicin had synergistic antibreast cancer efficacy.

natural products；doxorubicin；anti－breast cancer；drug combination；drug screen；MDA－MB－231；berberine

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.02.015

R965

A

1004－2407（2015）02－0152－04

2014－11－07）

上海市自然科学基金面上项目（编号：

12ZR1437700）

刘雯清，女，在读硕士研究生

＊通信作者：曹永兵，男，教授，博士生导师