三甲胺、二甲胺及氧化三甲胺含量测定方法的研究进展

陈锦文，崔燕芒，赵 燕＊（.第四军医大学药学院，西安 7003；.解放军第536医院药械科，西宁 80000）

三甲胺、二甲胺及氧化三甲胺含量测定方法的研究进展

陈锦文1，崔燕芒2，赵 燕1＊（1.第四军医大学药学院，西安 710032；2.解放军第536医院药械科，西宁 810000）

目的 综述多种检测二甲胺（DMA）、三甲胺（TMA）、氧化三甲胺（TMAO）含量的方法，并比较其优缺点，旨在找到一种灵敏度高、选择性强、操作简单的方法。方法 查阅国内外关于胺类化合物检测方法的基础性研究文献，并归纳总结。结果与结论采用衍生化气质联用法同时测定这三者的含量，可一次性批量处理多个样品，且灵敏度高、选择性强。

三甲胺；氧化三甲胺；二甲胺；含量测定

人体中三甲胺的来源一是直接从富含三甲胺（TMA）的食物中获取，二是由胆碱、左旋肉碱、甜菜碱等生物碱在肠道菌类的作用下转化为TMA。TMA在肠道中被有效吸收，并于肝脏中在三甲胺氧化酶（FMO3）的作用下转化为TMAO，后经肾脏代谢随尿液排出。DMA、TMA及其代谢产物氧化三甲胺（TMAO）微量分布于人体体液中，检测TMA、DMA、TMAO的含量，可作为临床诊断遗传性代谢紊乱疾病的指标［1］。更有研究证明，血管内过量TMAO将促使人体动脉粥样硬化，并导致患心脏病的风险上升［2］。在肾脏器质性病变的患者体液中，TMA和DMA含量明显上升［3］，且TMA会使末期肾病患者的神经毒性和尿毒症病情加重［4］。测定体液样品中这三者的含量，可帮助判断罹患心血管疾病和肾病的风险，警戒人们预防疾病的发生。此外，尿液样品中TMA、TMAO的含量则为临床诊断三甲胺尿症提供有利依据。因此，选择高效、简便的检测方法有着重大的临床实用意义。通过查阅相关文献，本文将现有TMA，DMA和TMAO常用检测方法列举如下。

1 分光光度法

由于低级脂肪胺没有发色团，无紫外吸收特征，故一般要对TMA和DMA进行衍生化处理。

1.1 苦味酸比色法 用无水甲苯将样品中的易挥发碱性物质TMA萃取到苯层，TMA与苦味酸反应生成黄色的苦味酸三甲胺盐，该化合物在410nm处有最大吸收波长，用紫外分光光度计测定萃取溶液在410nm处的吸光度，TMA浓度与吸光度之间线性关系良好，可用标准曲线法对TMA进行定量分析［5］。对于TMAO定量分析［6］，可用三氯化钛（TiCl3）还原成TMA，测得还原所得TMA的量，进而换算出样品中TMAO的含量。

1.2 雷氏盐比色法 TMAO也可在pH为1时，置于冰浴中与雷氏盐反应生成红色沉淀，将沉淀溶于体积分数70%丙酮中，用分光光度计在最大吸收波长525nm处测得其吸光度值，标准曲线法定量［7］。

分光光度法测定DMA含量则是由二甲胺与氯化铜及二硫化碳反应生成黄棕色二甲氨基二硫代甲酸铜，在430nm处测量溶液的吸光度，比色定量［8］。分光光度法是TMA、DMA、TMAO的经典检测方法，但是雷氏盐和苦味酸与样品中其他胺类物质发生反应，常使测量结果偏高。该方法灵敏度低，检出限较高，效率低且重复性差，常用于检测饲料及水产动物中TMAO的含量。

2 气相色谱法

Namies＇nik［9］探索出用固相微萃取技术对空气中的挥发性低级脂肪胺进行分离、浓集，H2作为载气，氢火焰离子化检测器的气相色谱仪对各组分进行分析，再用标准曲线法定量的方法。秦辉等［10］采用顶空气相色谱法测量河蟹中TMA的含量，将蟹肉组织研磨后，取一定量样品放入顶空瓶中，加入氢氧化钠，使TMA从组织中游离出来，超声波处理，40℃下保存30min后，不分流进样，1.5mL·min－1高纯度氮气、47mL·min－1氢气、400mL·min－1空气作为载气，采用程序升温的方式使沸点不同的组分在合适的温度得到分离（初始柱温40℃，保留3min，升温速率10℃·min－1，最终温度180℃，保留4min，用标准曲线法定量。Kamarei等［11］用溶剂棒液相微萃取技术（SBME）富集萃取废水样品中的脂肪胺类物质，氢火焰离子化－气相色谱法测定其含量。SBME与液液萃取原理相同，但有机溶剂用量只需几十微升，是一种非损耗型萃取方法。通过优化SBME条件，如：萃取剂的种类、接受相的离子强度、搅拌速率、提取时间、温度，可以达到最佳的提取效率。在壬醇为萃取剂，苯胺作为内标物，以200g·L－1氯化钠和0.1mol·L－1氢氧化钠混合溶液作接受相离子强度调节剂，搅拌速率为700r·min－1，溶液温度为45℃的条件下，萃取废水中的脂肪胺类物质趋近平衡，效率高。萃取完成后，用GC进样针抽取棒内溶剂，排除空气后，取1μL直接进GC分析。气相色谱中常用有机萃取和顶空进样以此避免繁杂的样品前处理，但是TMAO不具挥发性，需要在密闭的试管中还原成TMA，并加强碱使之呈气态，再采用顶空进样－气相色谱法测定含量，但在具体操作时易造成气态TMA的损失。气相色谱法灵敏度高、分析速度快，适用于痕量分析，但是低级脂肪胺类极性大，容易吸附在硅烷和硅氧烷等极性固定相上，造成拖尾峰和重影现象，重复性差。

3 气相色谱－质谱联用

测定生物样品中这三者的含量，因其浓度低需采用灵敏度高、高选择性的分析方法才能确保实验结果的可靠性。气相色谱－质谱联用分析灵敏度高，适于低分子挥发性化合物的分析，分离效率高，可用于定量分析复杂混合物。生物样品的分析包括样品的前处理（分离、纯化、富集）和对最终提取物的定量分析。对TMA、DMA和TMAO进行含量测定，在相关文献中报道了以下几种生物样品前处理方法。

3.1 衍生化法 衍生化法适用于被测物质不易被检测时，将其进行处理，如加上生色团等，使其生成可被检测的物质。孔彬［12］采用6－氨基喹啉－N－羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯（AQC）作为柱前衍生化试剂，建立一种衍生化反相高效液相色谱－荧光检测法同时检测人体血液中17种氨基酸。在气相色谱中应用衍生反应处理样品则是为了增加其稳定性和提高检测灵敏度。

由于在室温下TMA、DMA呈气态，样品储存过程中易挥发，且相对分子质量越小的脂肪胺类有机物越易吸附在极性固定相的表面，形成拖尾峰。DaCosta［13］将内标物TMA－d6、DMA－d6加入到待测生物样品中，处理后得到酸化的生物液体。在密闭的试管中进行衍生化，DMA与对甲苯磺酰氯反应生成N，N－二甲基对甲基磺酰胺，2，2，2－三氯乙基氯甲酸酯与TMA衍生化反应生成2，2，2－三氯乙基－N，N－二甲基氨基乙酸酯，所得衍生物均具有良好的稳定性，并且在气相分析过程中不会发生热分解。衍生物再用气相色谱－质谱联用技术定量分析。而测定生物样品中的TMAO含量，则是先将其在三氯化钛（TiCl3）作用下还原为TMA，再将TMA衍生化后进样分析测定。根据同位素内标法计算出样品中待测组分的含量。Sacher［14］用衍生化－气质联用技术测定了废水中一级胺和二级胺的含量，比较了2，4－二硝基氟苯和苯磺酰氯分别作为胺类衍生试剂对含量测定的影响，得出使用苯磺酰胺作衍生试剂的方法灵敏度更高、结果重复性更好的结论。衍生化法使样品中的TMA和DMA形成稳定的化合物，减少了样品储存过程中TMA和DMA的损失，实验结果更为可靠，且具有重复性好、灵敏度高的优点。

3.2 固相微萃取 固相微萃取（SPME）是将样品进行前期处理与富集，将探针浸入样品溶液或顶空气体中，待平衡后将纤维头取出插入汽化室，靠流动相将其导入色谱柱，完成提取、分离、浓缩的全过程，特别适用于样品中挥发性和半挥发性有机物的分析［15］。Chan［16］采用顶空固相微萃取－气质联用法同时测定了鱼肉组织中TMA、DMA和MA的含量，以此作为评判鱼肉新鲜程度的指标。经酸化的生物样品中加入丙胺（NPA）作为内标物，加入氢氧化钾将TMA从样品中游离出来，用复合型二乙烯基苯－羧基聚二甲硅氧烷固相微萃取纤维头，从样品上方的顶空气体中直接吸附萃取TMA、DMA，然后将纤维头插入气质联用色谱仪中进行定量分析，最后用内标法算出样品中两者的含量。对于样品中TMAO的测定，需要在酸性条件下用三价钛还原成TMA，再按照TMA测定方法测量。此法操作简便，快速，不需要使用溶剂，与气相、液相色谱仪联用有良好的线性和灵敏度，但SPME需要专门的萃取器，价格昂贵，且纤维头使用寿命有限，需要不停地更换，使测量成本变高，且样品不好保存，萃取后要立刻进样分析，实验操作繁杂。

3.3 采样管吸附－热解吸 Rahman［17］使用采样管吸附－热解吸－气质联用技术测定了被污染的环境样品中挥发性脂肪酸类物质、吲哚、粪臭素、苯酚、三甲胺的含量。发现了质谱提取离子流色谱模式和总离子流色谱模式对TMA含量测定结果不同，是由于TMA与采集管填充的吸附剂某些组分发生共溶析，所以最终选择了质谱检测器的提取离子流色谱模式检测TMA的含量。

4 离子色谱法

离子色谱法中，流动相携带TMA、DMA、TMAO进入分离柱时，因各阳离子对树脂亲和能力不同而分离，进入电导池检测后，得到色谱峰，再按照色谱定性定量方法进行待测组分的分析。样品进行离心处理后，取上层清液，用超纯水按一定比例稀释定容，直接进样测量。李丰［18］采用了非抑制型离子色谱法同时测定水产品中TMA、DMA、TMAO的含量，以3mmol·L－1甲磺酸作为流动相，流速为0.8mL·min－1，柱温30℃，电导池温度为35℃，得到了峰形好、分离度高的色谱峰。孙永［19］建立了一种同时测定水产品中TMAO及其分解产物TMA、DMA的非抑制性离子色谱法，4mmol·L－1硝酸＋体积分数为3%的乙腈混合溶液为淋洗液，流速为0.9mL·min－1，在此条件下，可在10min内完成待测组分的分析，缩短了分析时间，提高了分析效率。但由于生物样品中包含一些常见阳离子，如Ca2＋、Na＋、K＋、Mg2＋，考虑到这些离子会对实验造成较大干扰，离子交换色谱法并不是测量生物样品中胺类物质的最佳方案。

5 液相色谱法

液相色谱法是测定水中低级脂肪胺类含量的经典测量方法，由于该类化合物极性大、溶于水、具有挥发性，且对液相色谱检测器的响应值较高，无发色团，无荧光特性和紫外吸收特征，故往往要先将其衍生化以便达到易于分离、检测的目的。Campins－Falco等［20］将尿液中的β－苯乙胺萃取到C18固相微萃取柱上，与氯甲酸－9－芴甲酯（FMOC）衍生化，取100μL样品到液相色谱仪中分析含量。特别指出，在衍生化前，用pH为10的1g·L－1碳酸盐缓冲液冲洗萃取柱来消除尿液样品基质的干扰，使色谱分离效果更好。实验还测得丙胺、二甲胺与FMOC衍生化产率分别为101%和85%。也已有文献详细探讨了FMOC与胺类物质发生反应，得到转化率高的衍生产物所需要的实验条件［21］。Herr＇aez［22］比较了3种固相微萃取技术和衍生化反应过程，FMOC作为衍生化试剂，采用液相色谱仪对水中的MA、DMA、TMA定量分析。结果显示，如果样品中的胺类先与FMOC反应再对衍生产物进行萃取，测量TMA的灵敏度远远低于一级胺、二级胺，而用涂布FMOC的纤维头对水中DMA、TMA同时进行衍生化和萃取，该方法效果良好，检出限为5ng·mL－1，但其局限性在于纤维头上涂层面积有限，被分析物吸附率低。Campins－Falco［23］用毛细管内微萃取（in－tube SPME）作为水样品的预处理办法，在管内壁上涂布体积分数为95%羧基聚二甲硅氧烷和体积分数为5%聚二苯基硅氧烷混合溶液作为固定相，FMOC作为衍生试剂涂布在固定相上，样品流经管内时，胺类物质被萃取吸附在固定相上，并与FMOC反应，形成衍生物在吸附柱中得以洗脱，通过开关装置转换吸附柱和分析柱，在分析柱中以乙腈作为流动相，实现对水样品中低级脂肪胺类物质在线联用分析。

6 毛细管电泳法

Dabek－Zlotorzynska［24］采用柱前衍生化法使DMA与异硫氰酸荧光素酯（FITC）反应，激光诱导荧光检测器的毛细管电泳仪分离、测定DMA和其他低相对分子质量的胺类化合物，并探讨确定了在最佳的衍生化反应条件下得到的相对荧光强度为100%的DMA－FITC衍生物。在20mmol·L－1硼酸盐＋体积分数为20%的丙酮溶液、5mmol·L－1的二甲基－β－环糊精（DM－β－CD）为缓冲溶液，工作电压为25kV的条件下，分离效果最佳。此方法测定DMA的含量检出限为10－9mol·L－1，低于气相色谱法和高效液相色谱法，灵敏度高，可用来监测大气气溶胶或其他环境样品中DMA及其他低相对分子质量的胺类化合物的含量，但重复性较差。Timm［25］用毛细管电泳仪间接紫外检测法同时测定了鱼肉中TMA、DMA、TMAO的含量。4mmol·L－1甲酸、5mmol·L－1硫酸铜、3mmol·L－1冠醚、18－冠醚－6作为缓冲液，压力进样，可在5～10min内完成整个分析过程，检出限为0.04mmol·L－1。此法样品提取过程简单，不需要衍生化处理，分析速度快，但由于毛细管直径小，光路短，使用紫外检测器时，灵敏度较低，且影响电渗的因素多，进而影响重复性。

7 质谱法

质谱法是指将物质粒子转化为带正电的离子，并通过适当的电场、磁场将其按照质荷比大小依次排列成图谱记录下来。快原子轰击质谱以高速Ar原子轰击样品分子使之离子化，避免了对有机化合物的加热，适用于热不稳定的、难气化的、极性大的有机化合物分析。Mamer［26］用快原子轰击质谱和稳定同位素稀释法分别测定了尿液样品中TMA、TMAO含量，在已酸化的样品中加入内标15N－TMA·HCl，经乙醚提取，在冰水温度下加入氢氧化钠，再经乙醚萃取后，取20μL萃取物与氘代碘甲烷CD3I反应形成［15N（CH3）3C2H3］＋、［14N（CH3）3C2H3］＋，蒸发除去乙醚，加入30μL蒸馏水溶解残余物，取10μL进样，六乙二醇作为基质以减少杂质峰的干扰，用质谱法检测到碎片离子峰m／z77和78。在正常尿液样品中加入不同质量的14N－TMA对照品，检测到2种离子峰，以加入的14N－TMA的量为横坐标、离子峰强度之比为纵坐标制作标准曲线，所得曲线线性关系良好。测量TMAO的方法则是先将15N－TMA·HCl溶解于蒸馏水中，经双氧水氧化形成15N－TMAO盐酸溶液。将2μL15N－TMAO加入到100μL尿样中，取10μL进样，六乙二醇作为基质，质谱仪检测到［15N（CH3）3OH］＋、［14N（CH3）3OH］＋，分别对应离子峰m／z76和77。用该法绘得标准曲线线性关系良好。同位素稀释法不需要定量严格地分离出被测化合物，避免了对复杂混合物的纯化，在酸化的尿液样品中加入已知量的15N－TMA作为内标物，可消除基质效应造成的误差。此法以15N－TMAO为内标物，直接对尿液样品中的TMAO定量分析，避免了将TMAO还原为TMA时转化不完全造成的误差。

8 结语

三甲胺具有鱼腥臭味，是判定海产品新鲜程度的标准之一。三甲胺还与人类健康密不可分，三甲胺在酶作用下形成次级代谢产物氧化三甲胺，若在血管中积聚得过多易导致心血管疾病的发生。而患有肾脏疾病的患者体液中，二甲胺、三甲胺含量均明显上升。此外，测定尿液中的氧化三甲胺与三甲胺含量之比，已成为判断代谢紊乱疾病三甲胺尿症的临床指标。对于胺类化合物的含量测定一直是研究的热点，现有文献大多报道的是采用海产品、环境样品为基质的测定方法，而生物样品本身有别于其他样品，因此，无论在样品预处理还是在仪器的选用上，都需要深入研究。因此探讨出一种检测生物样品中三甲胺及其代谢产物的简单、高效的方法是很有必要的。现有的方法中，气质联用法和毛细管电泳法对于三甲胺的检测限低，分别在10－8～10－9mol·L－1之间，但由于毛细管电泳法的重复性差，不建议使用该法。采用气质联用－衍生化法可一次性将多个样品中的胺类物质衍生化，形成稳定的衍生物易于保存，而固相萃取技术不能同时进行多个样品的萃取保存。因此，可以采用气质联用－衍生化法，选择合适的衍生试剂和内标物，并根据胺类化合物的化学性质，调整色谱条件对生物样品中的三甲胺、二甲胺、氧化三甲胺进行定量分析。

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Research progress of content determination methods of trimethylamine，dimethylamine and trimethylamine－N－oxide

CHEN Jinwen1，CUI Yanmang2，ZHAO Yan1＊（1.School of Pharmacy，the Forth Military Medical University，Xi′an 710032，China；2.Devision of Drug and Device，People′s Liberation Army 536Hospital，Xining 810000，China）

Objective To review the methods for determining the contents of dimethylamine，trimethylamine and trimethylamine－N－oxide，also compare their advantages and disadvantages，then to find a method that has the characteristics of high sensitivity，strong selectivity，and operational simplicity.Methods The methods of detection of amines were summarized through reading the research literatures of domestic and abroad.Result and Conclusion Gas chromatography－mass spectrometry after derivatization can simultaneously measure the three amines，which could process samples in batches with high sensitivity and strong selectivity.

trimethylamine；trimethylamine－N－oxide；dimethylamine；content determination

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.02.036

R917

A

1004－2407（2015）02－0216－04

2014－09－10）

陈锦文，女，在读硕士研究生

＊通信作者：赵燕，女，副教授，硕士生导师