5-羟色胺监控中药注射剂过敏反应的可行性研究

汪 芳， 萧 伟 ， 王振中， 彭国平， 李存玉， 郑云枫， 陆 杨， 李红阳，

(1. 南京中医药大学药学院，江苏 南京210023;2. 江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港222001)

中药注射剂的过敏反应是最常见的不良反应之一［1］。过敏反应即变态反应，是外来性抗原物质与体内抗体间所发生的一种非正常免疫反应，具有明显的个体差异和遗传倾向，是一种IgE 水平异常增高的疾病状态［2-3］。过敏原一般无法通过色谱法进行分析，只能进行生物活性检测，常采用酶联免疫吸附实验法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)［4］，然而采用ELISA 检测大量过敏原样本的代价较高，难以普及。2010 年版《中国药典》中收载的注射剂过敏反应检测为豚鼠主动过敏反应检查法，豚鼠腹腔注射药物以致敏，再静脉注射进行攻击，观察动物竖毛、喷嚏、干呕、咳嗽、呼吸困难或抽搐、休克、死亡等过敏反应症状［5］，此法是以豚鼠表观现象为评价指标，监控药物过敏性，由于多因素的影响，此方法灵敏度不高，难以达到控制致敏程度有多样差异性过敏原的目标。过敏反应过程中会释放组胺、5-羟色胺等介质，本实验采用常用的过敏阳性药物卵蛋白及过敏反应较为严重的鱼腥草注射液［6-7］，对《中国药典》2010 年版中豚鼠过敏方法加以改良，考察致敏豚鼠在攻击前后血浆中5-羟色胺的含有量变化，计算其升高率，并进行统计学分析，分析组别差异性，以此来探讨5-羟色胺监控中药注射剂过敏反应的可行性。

1 实验材料

1.1 动物来源 健康成年豚鼠30 只，雄性，杂色，体质量接近，为(300 ±50)g，由南京青龙山动物养殖场提供，许可证号SCXK (苏)2007-0008，合格证号2027470。

1.2 仪器 Waters510 高效液相色谱仪，Waters 2465 电化学检测器(美国Waters 公司);EC2000 色谱工作站(大连伊利特分析仪器有限公司);Phd-200A 精密酸度计(上海博通经贸有限公司);TGL-16C 飞鸽牌离心机(上海安亭科学仪器厂);Lichrospher C6H6 色谱柱 (4.6 mm × 250 mm，5 μm，江苏汉邦科技有限公司，柱号为09092401);FZQ-II 型涡旋混合仪 (江苏泰县医疗器械制造厂);DG5033A 酶标仪(南京华东电子集团医疗装备有限责任公司)。

1.3 药品与试剂 氯化钠注射液(安徽丰原药业股份有限公司，批号100730103);卵蛋白(干粉)(Sigma 公司，批号026K5448);水合氯醛(天津市科密欧化学试剂有限公司，批号0803116)，庚烷基磺酸钠(J＆K CHEMICALLTD，批号235385);GBD Guinea pig IgE Elisa Kit (美国R＆D 公司，批号H026-09);鱼腥草(采于南京郊区，经江苏省药品检验所胡浩斌教授鉴定为三白草科鱼腥草);乙腈(色谱纯，Merck 公司);超纯水。

2 实验方法

2.1 供试品配制 卵蛋白溶液:取卵蛋白适量，用0.9%氯化钠注射液配制成质量浓度为5 mg/mL 的卵蛋白溶液。鱼腥草注射液:取新鲜鱼腥草2 000 g 进行水蒸气蒸馏，收集初馏液200 mL，进行重蒸馏，收集重蒸馏液约100 mL，加入7 g 氯化钠及5 g 吐温-80，混匀，加注射用水至1 000 mL，滤过，灌封，灭菌，即得。

2.2 豚鼠过敏试验方法 根据供试品进行动物分组，分别为:氯化钠注射液组(NS)、卵蛋白组(OVA)、鱼腥草注射液组(YXCI)。取杂色豚鼠30 只，体质量250 ～350 g，雄性，按《中国药典》2010 年版附录ⅩⅧG 中药注射剂安全性检查法应用指导原则中过敏反应检查法进行改进，隔日每只每次腹腔注射供试品0.5 mL，共3 次，进行致敏。然后在首次注射后第21 天，由肌肉注射供试品0.5 mL 进行攻击。于攻击前以10%水合氯醛(0.3 mL/100g)麻醉豚鼠，颈动脉取血1 mL，肝素抗凝。肌肉注射供试品0.5 mL 进行攻击，于攻击后15 min 和30 min 分别颈动脉取血1 mL，肝素抗凝。血样2 000 r/min 离心10 min，取上清血浆，-80 ℃冷冻，留备检测。

2.3 酶免法测定血浆IgE 攻击前和攻击后15 min、30 min 豚鼠颈动脉取血，离取血浆，使用前混匀。ELISA 操作步骤:①取出试剂盒平衡至室温。②反应板每孔分别加入20 μL 标准品、20 μL 血浆。③每孔加入100 μL 缓冲液(Zero Buffer)，轻轻混匀30 s，室温温育30 min。④洗板:甩尽板内液体，用蒸馏水或者洗涤液洗涤反应板，并去除水滴(在厚迭吸水纸上拍干)这样反复洗涤5 次。⑤每孔加入150 μL 酶联物(Reagent)，轻轻混匀10 s，室温温育30 min。⑥洗板，方法与步骤4 相同。⑦每孔加入100 μLTMB 显色液，轻轻混匀10 s，置暗处室温温育20 min。⑧每孔加入50 μL 终止液(stopsolution)，轻轻混匀30 s，确定蓝色变为黄色，30 min 内在450 nm 处读OD 值。

2.4 5-羟色胺的测定 取豚鼠血浆100 μL 避光解冻，加入等量甲醇，混匀，涡旋30 s，3 000 r/min 离心10 min，冷冻30min，取出，10 000r/min 离心10min，取上清液进样检测。色谱条件:Hedera ODS-2 (150mm ×4.6mm，5 μL，江苏汉邦科技有限公司，柱号08022009);柱温25 ℃;流动相为25 mmol/L 磷酸二氢钠(内含0.5mmol/L 乙二胺四乙酸二钠，3 mmol/L 庚烷磺酸钠，pH 4.6)-乙腈(85 ∶15)，用前0.45 μm 滤膜真空抽滤，体积流量0.8 mL/min;ISAAC 参比电极，检测电位0.6 V，进样量20 μL。

3 结果

3.1 IgE 测定结果

3.1.1 线性关系考察 精密称取IgE，配成质量浓度为10、20、40、80、160、200、320 ng/mL 进行试验，以质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，得IgE 回归方程为y =0.014 4x + 0.2572 (r2=0.991 1)。结果表明，IgE 在10 ～320 ng/mL 范围内与其吸光度值呈良好的线性关系。

3.1.2 血浆IgE 酶联免疫测定结果 3 组豚鼠血浆IgE 水平变化见图1。卵蛋白组攻击后15 min 豚鼠血浆中IgE 的升高率平均为20.02%，攻击后30 min 为71.16%，二者平均为45.58%;鱼腥草组攻击后15 min 豚鼠血浆IgE 的升高率平均为15.77%，攻击后30 min 为56.33%，二者平均为36.05%。卵蛋白、鱼腥草注射液所引起的IgE 升高率均高于生理盐水组9.43%。卵蛋白在攻击后15 min 豚鼠血浆中IgE 的平均升高率与生理盐水组有较显著性差异，P ＜0.05;卵蛋白在攻击后30 min 豚鼠血浆中IgE 的升高率与生理盐水组有显著性差异，P ＜0.001;鱼腥草注射液在攻击后15 min 豚鼠血浆中IgE 的升高率与生理盐水组无显著性差异，P ＞0.05;鱼腥草注射液在攻击后30 min 豚鼠血浆中IgE 的升高率与生理盐水组有显著性差异，P ＜0.001。

图1 各组别豚鼠过敏后血浆免疫球蛋白E 升高率/%

3.2 5-羟色胺测定结果

3.2.1 线性关系考察 5-羟色胺的色谱图见图2。精密称取5-羟色胺适量，配成质量浓度为30、60、120、240、600、900、1 500 ng/mL 进样，以标准液质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得5-羟色胺回归方程为y=0.509 4x-4.426 7 (r2=0.996 8)。结果表明，5-羟色胺在30 ～1 500 ng/mL 范围内与其峰面积积分值呈良好的线性关系。

图2 5-羟色胺色谱图

3.2.2 血浆5-羟色胺测定结果 3 组豚鼠血浆中5-羟色胺变化见图3。卵蛋白与鱼腥草注射液攻击后，豚鼠血浆中5-羟色胺均有不同程度升高，卵蛋白组攻击后15 min 豚鼠血浆中5-羟色胺升高率平均为16.50%，攻击后30 min 为59.99%，二者平均为38.24%;鱼腥草注射液攻击后15 min 豚鼠血浆中5-羟色胺的升高率平均为35.63%，攻击后30 min 为76.31%，二者平均为55.96%;卵蛋白、鱼腥草注射液攻击后5-羟色胺升高率均高于生理盐水的7.47%。将卵蛋白、鱼腥草注射液攻击后5-羟色胺的升高率与生理盐水组进行t 检验，卵蛋白攻击后15 min，5-羟色胺升高率与生理盐水组有显著性差异，P ＜0.01;卵蛋白攻击后30 min，5-羟色胺升高率与生理盐水组有显著性差异，P ＜0.001。鱼腥草注射液攻击后15 min 和30 min，5-羟色胺升高率与生理盐水组均有显著性差异，P ＜0.001。

图3 各组别豚鼠过敏后血浆5-羟色胺升高率

4 讨论

通过对5-羟色胺的检测条件优化，磷酸二氢钠缓冲盐-乙腈系统的峰形优于醋酸钠缓冲盐-乙腈系统，其比例85 ∶15 可以将5-羟色胺与其他成分基线分离且出峰时间合适，最低检测限基本可以满足样品检测要求。本实验同时对豚鼠体内另一内源性过敏介质组胺进行了检测条件的优化，通过邻苯二甲醛在碱性条件下对组胺衍生化，磷酸终止反应，磷酸二氢钠缓冲盐-乙腈(65 ∶35)，最低检测限可以达到约20 ng，但豚鼠血浆样品中组胺水平常低于检测限，无法进行数据分析，故仅对豚鼠血浆中的5-羟色胺水平进行了检测分析。

图4 各组别豚鼠过敏后血浆5-羟色胺和免疫球蛋白E 升高率

一般中药注射剂所发生的过敏反应是由IgE 所介导的Ⅰ型变态反应，当机体致敏后再次接触过敏原会发生过敏反应，导致肥大细胞破裂及嗜碱性粒细胞脱颗粒，从而释放过敏介质［8-10］。通过对IgE 及过敏介质5-羟色胺进行检测，发现在发生过敏反应后，IgE 和5-羟色胺均有不同程度的升高，且阳性药与空白组均有较显著性差异。对鱼腥草注射液攻击后IgE 升高率和5-羟色胺升高率进行比较检验，没有显著性差异，均P ＞0.05。卵蛋白和鱼腥草注射液致敏后，IgE 和5-羟色胺变化趋势基本一致，二者曲线相关系数r 为0.82，见图4。由于过敏性介质5-羟色胺可以通过高效液相直接检测，所以用5-羟色胺控制中药注射剂过敏反应可行，既可以提高检测速度，又能降低检测成本。

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