Box-Behnken 设计-效应面法优选乳痛软坚片挥发油包合工艺

唐 林， 夏新华 ， 周莉莉， 杜 阳

(湖南中医药大学药学院，湖南 长沙410208)

乳痛软坚片系由柴胡、陈皮、延胡索、蛤壳粉等组成，临床用于治疗肝郁气滞型［1］、痰瘀互结型［2］的乳腺增生病疗效显著。处方中柴胡、陈皮、当归、莪术含有大量挥发油，临床应用和现代药理研究表明挥发油具有较强的生理活性［3-6］，但其成分容易挥发，给生产和储存带来了不便。为增加挥发油在该制剂中的稳定性，保证制剂的质量，本实验采用Box-Behnken 设计-效应面法对该制剂挥发油的β-环糊精包合工艺条件进行了优化。

1 仪器与试药

1.1 仪器 分析天平XB 220A (Precisa Balance series XB);集热式恒温加热磁力搅拌器DF-101 (巩义市予华仪器有限责任公港东科技发展股份有限公司)，挥发油测定器、真空干燥箱。

1.2 试药 β-环糊精(天津市光复精细化工研究所)，无水乙醇(分析纯)，石油醚(分析纯，成都市科龙化工试剂厂)等。柴胡、当归、陈皮、莪术中药饮片均购自湖南百佳中药饮片厂，经检验以上中药饮片均符合《中国药典》2010 年版规定。

2 方法与结果

2.1 挥发油的提取 按处方比例称取柴胡、陈皮、当归和莪术四味中药饮片的最粗粉，加10 倍量的水，按《中国药典》2010 年版一部附录ⅩD 挥发油测定法(甲法)提取5 h，收集挥发油，加入无水硫酸钠脱水，即得混合挥发油。

2.2 挥发油包合方法的选择

2.2.1 饱和水溶液法 取β-环糊精6 g，精密称定，置于锥形瓶中，加水150 mL，加热溶解，放冷并于磁力搅拌器上恒温于40 ℃，缓缓加入1 mL 挥发油(预先配成50%的无水乙醇溶液)，恒温搅拌3h，放冷至室温，置冰箱冷藏24 h，抽滤，包合物用少量水洗涤，再用石油醚冲洗3 次(每次10 mL)，40 ℃真空干燥5 h，称定质量，计算包合物收率。

2.2.2 研磨法 取β-环糊精6 g，精密称定，置于研钵中，加3 倍量水，研磨均匀。量取挥发油1 mL 配成50%的无水乙醇溶液，缓缓加入乳钵中，连续研磨3 h 至成糊状，抽滤，包合物用少量水洗涤，再用石油醚冲洗3 次(每次10 mL)，40 ℃真空干燥5 h，称定质量，计算包合物收率。

2.2.3 两种包合方法挥发油包合率的测定 按《中国药典》2010 年版一部附录XD 挥发油测定法(甲法)测定，精密量取混合挥发油1.00 mL，置圆底烧瓶中，放数粒沸石，加蒸馏水300 mL，连接挥发油提取器，加热至沸，并保持微沸2 h 以上，至油量不再增加，记录挥发油回收量，计算空白回收率。另取上述二种包合方法制备的挥发油包合物，同法操作，按下式计算挥发油包合率。结果表明，研磨法的挥发油包合率明显高于饱和水溶液法，故选择研磨法用于挥发油的的包合(见表1)。

表1 两种包合方法的比较(n=3)

2.3 研磨法包合工艺影响因素的考察

2.3.1 研磨时间的影响 取β-环糊精6 g，共6 份，精密称定，置于研钵中，加3 倍量水，研磨均匀。量取挥发油1 mL (预先配成50%的无水乙醇溶液)，缓缓加入研钵中，分别连续研磨0.5、1、1.5、2、2.5、3 h 至成糊状，抽滤，包合物用少量水洗涤，再用石油醚冲洗3 次 (每次10 mL)，40 ℃真空干燥5 h，称定质量，计算包合物收率，并按“2.2.3”项下方法测定挥发油包合率。结果表明，包合时间对包合物收率的影响不大，但随着时间延长，挥发油包合率逐渐增大，研磨2 h 后，挥发油包合率趋于稳定(见图1)。

2.3.2 β-CD 用量的影响 分别称取β-环糊精4、6、8、10 g，精密称定，置于研钵中，加3 倍量水，研磨均匀。精密量取挥发油1 mL (预先配成50%的无水乙醇溶液)，缓缓加入研钵中，连续研磨2 h 至成糊状，其余操作同“2.3.1”项。结果表明，β-CD 用量对对包合物收率影响基本不大，但对挥发油包合率影响显著，挥发油包合率随着β-CD 用量加大先增加后稳定接着又有所增加(见图2)。

图1 研磨时间对包合工艺的影响

图2 β-CD 用量对包合工艺的影响

2.3.3 加水量的影响 取β-环糊精6 g，共4 份，精密称定，置于研钵中，分别加2、3、4、5 倍量的水，研磨均匀。精密量取挥发油1 mL (预先配成50%的无水乙醇溶液)，缓缓加入研钵中，连续研磨2 h 至成糊状，其余操作同“2.3.1”项。结果表明，随着加水量增加，包合物收率先增大后减小，3 倍量时包合物收率较大，挥发油包合率则从3 倍加水量时逐渐下降，4 倍量水后又逐渐趋于稳定(见图3)。

图3 加水量对包合工艺的影响

2.3.4 乙醇用量的影响 取β-环糊精6 g，共4 份，精密称定，置于研钵中，分别加3 倍量水，研磨均匀。精密量取挥发油1 mL，共4 份，分别加入无水乙醇1、2、3、4 mL 混匀，缓缓加入研钵中，连续研磨2 h 至成糊状，其余操作同“2.3.1”项。结果表明，当无水乙醇用量与挥发油量1 ∶1时，挥发油包合率和包合物收率达到最大(见图4)。

图4 乙醇用量对包合工艺的影响

2.4 Box-Behnken 设计-效应面分析法优选包合工艺条件

2.4.1 设计方案与实验结果 基于上述研磨法包合工艺影响因素考察的结果，选取β-CD 用量、加水量、研磨时间为考察因素，每个因素设计3 个水平(低中高3 个水平分别以-1、0、1 进行编码，见表2)，以挥发油包合率为响应值(Y)，采用Design-Expert 8.05 软件生成Box-Behnken设计方案，参照“2.2.2”项和“2.2.3”项下的方法制备各方案的包合物并测定其挥发油包合率，结果见表3。

表2 Box-Behnken 设计因素水平

2.4.2 模型拟合与显著性检验 采用Design-Expert 8.05软件对上述实验数据进行多元回归拟合，得到挥发油包合率(Y)对β-CD 用量(A)、加水量(B)、研磨时间(C)的二次回归模型:Y = - 231.41 + 35.84A + 34.25 B +81.77C - 1.80A2- 5.78B2- 17.71C2，决定系数R2=0.950 2。对回归模型及其系数进行方差分析(ANOVA)，可知该模型达到极显著水平(P ＜0.01)，且失拟项(Lack of Fit)不显著(P ＞0.05)，表明该模型实验误差小，模型拟合良好。但模型中A、B 二项系数的P 值大于0.05，表明因素A、B 对模型的响应值(挥发油包合率)影响较小(见表4)。

2.4.3 响应面分析与优化 根据上述模型方程，采用Design-Expert 8.05 软件，作三维图，如图5 ～7 所示。由三维图中的曲面和等高线可以直观地看出，研磨时间对挥发油包合率的影响显著，而β-CD 用量与加水量的影响则不大，但随着加水量和投料比例的增加，包合率都是先增大后减小;当加水量约为3 倍量、β-CD 用量约为挥发油投料量的10 倍、研磨时间约为2.5 h 时，包合率接近最大值。另外，根据包合物制备中要求包合率越大越好，通过Design Expert 8.05 软件可找出最优的包合工艺方案，即β-CD 用量为挥发油投料量的10.06 倍，加2.90 倍量的水，研磨2.31 h。

表3 Box-Behnken 设计方案与试验结果

表4 二次回归模型方差分析

2.4.4 模型预测与验证 考虑到实际操作方便，将上述最优包合工艺方案修正为:β-CD 用量为挥发油投料量的10倍，加3 倍量的水，研磨2.5 h。在此条件下，挥发油包合率的理论值为91.57%。按修正后的最优包合工艺条件进行验证试验，实际测得挥发油包合率为90.15% ±1.07%，与理论预测值较接近，说明该模型拟合度高。

3 讨论

3.1 目前环糊精包合工艺的优选应用最多的是正交设计，几乎达到了普及的程度，该设计实验次数少，数据处理简单。但当需要控制影响因素微小变化而响应值变化较大时，采用正交设计产生的偏差较大［7］。Box-Behnken 设计-效应面法是统计与设计试验技术的合成，该法的在各个方面的应用已日趋成熟［8-9］，在进行非线性模式设计和研究中具有优势;对中心点进行重复实验可提高实验的精密度;采用多元二次方程拟合因素和效应值之间的函数关系，再通过对回归方程的分析可寻求最佳工艺参数［10］。本研究表明Box-Behnken 设计-效应面法用于优选挥发油β-CD 包合工艺可行，预测值与真实值非常接近，同时所得结果直观、精确，便于分析。

图5 加水量和β-CD 用量对挥发油包合率影响的三维图

图6 环糊精用量和研磨时间对挥发油包合率影响的三维图

3.2 在Box-Behnken 设计中，要注意各考察因素中心点水平的选择，它对于顺利获得最优试验方案(或工艺条件)具有重要意义。一般可先通过单因素试验了解各考察因素的不同试验条件(水平)对效应值(评价指标)的影响情况，再结合专业知识选取各因素具有最大(或接近最大)效应值的试验条件作为中心点水平。

图7 研磨时间和加水量对挥发油包合率影响的三维图

3.3 挥发油包合物的评价指标通常有挥发油包合率、包合物收率、含油率等，不同的制备方法及不同成分的挥发油的包合，评价指标也各不一样［11］。挥发油包合率是挥发油包合物评价指标当中最直接也是最准确的评价方法，应用也最为广泛，挥发油包合率越高，包合效果越好，而包合物收得率和含油率在大批量实际生产中也有重要的意义［12-13］，在本实验中由于在单因素考察中已经表明包合物收率随着各因素及水平的变化影响较小，故在优选工艺中没有将其作为评价指标。

［1］ 陈其华，刘 慧. 乳痛软坚片治疗乳腺增生病41 例［J］.中医杂志，2011，52(23):2048-2049.

［2］ 胡金辉，袁轶峰. 乳痛软坚片治疗痰瘀互结型乳腺增生病30 例临床观察［J］. 中医药导报，2008，14(2):32-34.

［3］ 项秀娣，吕圭源，陈素红，等. 莪术油质量控制及药理研究进展［J］. 中国现代应用药学，2010，27 (11):979-982.

［4］ 牛向荣. 柴胡药理作用研究概述［J］. 中国药师，2009，12(9):1310-1312.

［5］ 李元波，侯世祥. 当归挥发油的包合工艺［J］. 中国中药杂志，2007，32(11):1100-1101.

［6］ 李庆耀，梁生林. 陈皮的药用研究进展［J］. 中成药，2008，30(2):246-248.

［7］ 郝吉福，李 菲，王建筑，等. 两种实验优化方法的比较研究:在制备薄荷油-β-环糊精包合物过程中的应用［J］.中成药，2011，33(8):1319-1320.

［8］ 柳 俊，张建军. Box-Behnken 效应面法优化白芍配方颗粒提取工艺［J］. 中国实验方剂学杂志，2011，17(1):10.

［9］ Li P，Lu S Q，Shan T J，et al. Extraction optimization of water-extracted mycelial polysaccharide from endophytic Fungus Fusarium oxysporum Dzf17 by response surface methodology［J］. Int J Mol Sci，2012，13(5):5441-5453.

［10］ 伍勇富，吴平江. Box-Behnken 设计-效应面法优化木犀草素-β-环糊精包合物的制备工艺研究［J］. 中草药，2010，41(7):1094-1095.

［11］ 郝晶晶，李海亮，龚慕辛. 挥发油环糊精包合技术的研究进展及存在问题分析［J］. 中国实验方剂学杂志，2013，19(2):352-355.

［12］ 刘 宇，殷中琼，魏 琴，等. 油樟叶挥发油β-环糊精包合物的制备工艺研究及稳定性考察［J］. 中国中药杂志，2013，38(13):2106.

［13］ 司 奇，吴 丹，曹青日，等. 缬草挥发油β-环糊精包合物的制备与评价［J］. 中国中药杂志，2013，38(14):2310-2312.