白藜芦醇固体脂质纳米粒的处方和制备工艺优化

朱可馨， 王志成， 王 冰* ， 张 彤*

(1. 上海中医药大学，上海201203;2. 上海市中医医院，上海200071)

白藜芦醇(resveratrol，Res)是一种多酚类化合物，具有降低血脂、保护心血管、抗肿瘤、抗氧化等药理作用［1］，研究发现白藜芦醇还具有抑制钙库释放钙离子从而抑制血小板活性，起到抑制血小板聚集的作用［2］。因白藜芦醇为多酚类化合物，极性较强、难溶于水，易溶于三氯甲烷、甲醇、乙醇、丙酮等强极性溶剂中［3］，从而口服生物利用度较低，研究结果显示其对光不稳定，因此给临床使用带来不便。固体脂质纳米粒(solid lipid nanopartieles，SLN)是采用生理相容的高熔点脂质材料作为载体，将药物包裹在类脂核中或吸附于纳米粒表面制成固体胶粒给药系统［4］。能改善药物溶解性，提高稳定性，具有靶向性的特点，进而达到提高药效的作用［5］。将白藜芦醇制成固体脂质纳米粒能够改善药物的溶解性［6］，提高生物利用度。现有的白藜芦醇剂型有酒剂及脂质体等。其中酒剂药物适用人群范围较小、脂质体稳定性较差且使用三氯甲烷、甲醇等溶剂，因此不适宜临床使用。基于白藜芦醇的物理化学性质及固体脂质纳米粒的制剂优势，本实验在单因素考察基础上，结合星点设计效应面法优化制剂工艺，为制备稳定性好、载药量高的白藜芦醇固体纳米脂质粒(Res-SLN)提供初步研究数据。

1 材料与方法

1.1 仪器 Agilent 1200 高效液相色谱仪(美国Agilent 公司);RE-52AA 旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂);SB3200 超声波清洗器(上海千载科技有限公司);激光粒径测定仪Nano ZS 90 (英国马尔文公司);XS105DU 型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);SB5200D 超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 药品与试剂 白藜芦醇对照品 (批号111535-200502，购自中国食品药品检定研究院，供含量测定);白藜芦醇原料 (上海施丹德生物制品有限公司，纯度≥98.0%);单硬脂酸甘油酯(国药集团化学试剂有限公司，化学纯);三硬脂酸甘油酯(上海阿拉丁试剂公司);泊洛沙姆188 (BASF 公司，注射级);蛋黄卵磷脂(上海艾韦特医药科技有限公司，注射级);胆酸钠(上海源聚生物科技有限公司);其他试剂购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

2 实验方法

2.1 Res-SLN 的包封率与载药量测定方法

2.1.1 色谱条件［7］Topsil C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);流动相为乙腈-水(25 ∶75);检测波长306 nm;体积流量1 mL/min;柱温25 ℃;进样量为20 μL。

2.1.2 标准曲线和方法学验证 称取白藜芦醇对照品5 mg，精密称定，用甲醇溶解定容至5 mL，制得对照品贮备液。吸取白藜芦醇对照品贮备液加甲醇制成1.01、2.02、4.04、8.08、16.16 和32.32 μg/mL 的对照品溶液，注入液相色谱仪，以峰面积为纵坐标，白藜芦醇质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.1.3 Res-SLN 的包封率及载药量测定 将白藜芦醇固体脂质纳米粒的混悬液置于超滤离心管(截留量为10 kDa)中，高速离心(10 ℃，转速为15 000 r/min，离心时间为50 min)，取下清液，稀释适当倍数，按前述色谱条件测得游离药物浓度，以下述公式计算包封率及载药量:

2.1.4 超滤法回收率试验 称取卵磷脂0.12 g，加入30 mL 丙酮-无水乙醇(1 ∶1)，完全溶解。称取单硬脂酸甘油酯0.12 g，加热熔融后与上述溶液混合均匀得到油相。取240 mL 质量浓度为0.5 mg/mL 的F68 ∶胆酸钠(1 ∶1)溶液为水相。将油相50 ℃减压浓缩得到油膜，加入水相后置于50 kHz 超声波清洗器中超声40 min，制备得到空白固体脂质纳米粒混悬液。取500 μL 空白固体脂质纳米粒混悬液3 份于超滤离心管中，分别加入40、50、60 μg 白藜芦醇对照品后，离心(10 ℃，15 000 r/min，50 min)，取下层，按上述色谱条件测定，计算加样回收率。

2.2 不同制备方法筛选 采用溶剂乳化挥发法、薄膜超声分散法、微乳分散法和水性溶剂扩散法进行白藜芦醇固体脂质纳米粒制备方法筛选。油相的制备:称取白藜芦醇24 mg，蛋黄卵磷脂40 mg，单硬脂酸甘油酯0.12 g，将蛋黄卵磷脂与Res 置于烧杯中，加入30 mL 无水乙醇溶解，再将单硬脂酸甘油酯(60 ℃加热熔融)与上述溶液混合，即得。水相的制备:配制质量浓度为0.1 mg/mL 的泊洛沙姆188 水溶液，量取160 mL 泊洛沙姆188 水溶液于250 mL 锥形瓶中，即得。

2.2.1 溶剂乳化挥发法 根据参考文献［8］，将水相于50℃水浴保温，以500 r/min 速度均匀搅拌，将油相注入水相液面下，待注入完成后取出，于室温条件下继续搅拌30 min，再用旋转蒸发仪真空浓缩(50 ℃)至4 mL 得初乳。另取20 mL 水相于50 mL 锥形瓶中，置于冰浴中保温，同时以500 r/min 速度均匀搅拌，再将初乳注入水相液面下，注入完成后于冰浴中继续搅拌2.5 h，即得白藜芦醇固体脂质纳米粒混悬液。

2.2.2 薄膜超声分散法

2.2.2.1 方法1 将油相置于250 mL 茄形瓶中，以旋转蒸发仪真空浓缩(50 ℃)，蒸干后得到油膜，将茄形瓶置于超声波清洗器中，用蠕动泵将160 mL 水相以3 mL/min 的速度注入油膜，再将混悬液转移至超声波细胞粉碎机继续超声处理，设置条件为超声时间为3 s，间歇为5 s，全程时间为12 min，即得白藜芦醇固体脂质纳米粒混悬液。

2.2.2.2 方法2 将油相置于250 mL 茄形瓶中，以旋转蒸发仪真空浓缩(50 ℃)，蒸干后得到油膜，将160 mL 水相加入茄形瓶中，以超声波清洗器继续超声处理40 min，即得Res-SLN 混悬液。

2.3 微乳分散法 水相以500 r/min 转速搅拌，50 ℃水浴保温，将油相注入160 mL 水相液面下，待注入完成，取出，得到微乳。另取20 mL 水相于50 mL 锥形瓶中，置于冰浴中保温，同时以500 r/min 速度均匀搅拌，将微乳距离水相液面6 cm 处注入，待注入完成后冰浴保温，继续搅拌15 min，即得Res-SLN 混悬液。

2.4 水性溶剂扩散法 水相以500 r/min 转速搅拌，50 ℃水浴保温，将油相注入160 mL 水相液面下，待注入完成，取出，在室温下继续搅拌30 min，即得白藜芦醇固体脂质纳米粒混悬液。

2.5 单因素考察 考察脂质材料、油相卵磷脂与脂质材料比、水相表面活性剂种类、有机溶剂种类、水相温度、超声功率、超声时间、药脂比、水相体积、水相质量浓度对粒径大小以及稳定性的影响。

2.6 星点设计优化 根据单因素试验结果，选择对结果影响较显著的3 个因素作为考察对象，即药脂比(X1)、水相油相体积比(X2)、水相表面活性剂质量浓度(X3)，因素取值范围分别为X1为3 ～5;X2为5 ～8;X3为0.1 ～0.5 mg/mL，以粒径大小(Y1)、粒径分布指数PDI (Y2)、载药量(Y3)作为因变量(效应值)，采用星点效应面法优化处方。采用三因素五水平星点设计，实验设计见表1。

表1 星点设计因素水平

3 结果

3.1 载药量与包封率的确定 所得标准曲线计算线性回归方程为:Y=116.43X+23.46 (r2=0.999 5)。结果表明白藜芦醇在1.01 ～32.32 μg/mL 质量浓度范围内线性关系良好。低、中、高质量浓度日内精密度RSD 依次为2.7%，2.9%和0.4%，日内精密度良好。超滤法回收率实验得到低、中、高质量浓度(1.01、8.08、32.32 μg/mL)加样回收率为96.1%、94.8%、97.1%，RSD 均小于3.0%。该方法精密度、准确性良好，且超滤法回收率实验表明离心管对于药物无吸附，可用于载药量及包封率的测定。

3.2 制备方法筛选 取4 种方法制得的Res-SLN 样品，按照前述方法测定包封率、载药量及粒径，实验结果见表2。结果表明，采用溶剂乳化挥发法、薄膜超声分散法制备的白藜芦醇固体脂质纳米粒的包封率均在90%以上，载药量在15%以上，而微乳分散法和水性溶剂扩散法制得样品的包封率仅为37.76%和54.57%，载药量均为10%左右;从粒径结果看，两种薄膜超声分散法所得样品的粒径分别为285.50 nm 和196.80 nm，溶剂乳化挥发法所制样品粒径最大，微乳分散法和水性溶剂扩散法所制样品粒径最小。结合载药量、包封率及粒径三个因素综合考虑，选择薄膜超声分散法的方法2 为Res-SLN 的制备方法。

表2 不同制法的Res-SLN 样品测定结果(n=3)

3.3 处方及工艺优化

3.3.1 处方单因素考察 考察脂质材料、油相卵磷脂与脂质材料比、水相表面活性剂种类与有机溶剂种类对粒径大小的影响，并且观察样品在室温下静置3 h 后的样品的颜色外观、均匀度，以及底部是否有沉淀等现象，以综合考虑样品稳定性，结果见表3。

表3 薄膜超声分散法脂质材料单因素考察结果

综上，由脂质材料单因素考察结果可以看出，脂质材料选择为单硬脂酸甘油酯、油相卵磷脂与脂质材料比例为1 ∶1，且水相表面活性剂选择为胆酸钠-F68 (1 ∶1)、有机溶剂选择为无水乙醇-丙酮(1 ∶1)时制备的白藜芦醇固体脂质纳米粒样品粒径较小且较为稳定。

3.3.2 制备工艺单因素考察 考察水相温度、超声功率、超声时间、药脂比、水相体积、水相质量浓度对粒径大小的影响并综合考虑稳定性的影响。结果见表4。

表4 薄膜超声分散法单因素考察结果

综上，由制备工艺单因素考察结果可以看出，当超声水相温度选择为室温，超声功率选择为50 kHz，超声时间为40 min，并且选用药脂比为1 ∶3、且水相体积选择为300 mL，水相质量浓度选择为0.1 mg/mL，所制备的Res-SLN 样品粒径较小、较为稳定。

3.4 星点设计优化试验

3.4.1 结果 根据三因素五水平星点设计(表1)制备不同处方的白藜芦醇固体脂质纳米粒，测定粒径及载药量，实验结果见表5。

表5 星点设计试验结果

3.4.2 模型拟合 运用Design expert 统计软件对各水平进行多元非线性回归，得到二项式拟合的方程为:

结果表明各效应与两因素各水平的非线性拟合效果较好，其中Y1、Y3复相关系数较大。

3.4.3 效应面优化与预测 根据二项式方程，绘制对处方影响显著的影响因素的三维效应面图，各因素对载药量的影响效应面见图1 ～3。重叠各个效应面的最优区域，得到制备Res-SLN 的较优工艺参数是药脂比为3;水相油相体积比为8;水相表面活性剂质量浓度为0.5 mg/mL。

图1 药脂比及水相油相体积比对载药量的影响效应面

图2 药脂比及水相表面活性剂质量浓度对载药量的影响效应面

3.4.4 工艺参数优化验证结果 按优化处方制备3 批Res-SLN 混悬液，测得其粒径大小、粒径PDI 和载药量分别为142.7 nm、0.307 和21.35%;3 次预测的结果分别为158.06 nm、0.34 和24.0%，偏差值分别为- 9.7%、-9.7%和-10.8%，预测值与实测值接近，说明模型拟合效果较好。

4 讨论

本实验对4 种RES-SLN 制备方法进行筛选，其中，微乳分散法与水性溶剂扩散法的包封率远低于溶剂乳化挥发法以及薄膜超声分散法，根据参考文献［9］，当处方组成相同时，使用不同的制备方法对于包封率的影响较大。溶剂乳化挥发法中第一步得到初乳的方法与微乳分散法及水性溶剂扩散法相似，但溶剂乳化挥发法中得到初乳后蒸发浓缩，进一步复乳化，得到固体脂质纳米粒混悬液包封率较高。

图3 水相油相体积比及水相表面活性剂质量浓度对载药量的影响效应面

RES-SLN 制备方法的筛选中，微乳分散法与水性溶剂扩散法制得的样本没有经过超声过程，粒径均小于制备中有超声过程的溶剂乳化挥发法以及薄膜超声分散法，根据参考文献［10］，超声波对于大颗粒的粒子具有均匀细化的作用，但是对于粒径小的粒子作用并不明显。超声过程中均伴随热量的释放，产生的热量越大，粒子可能产生重新聚集现象从而粒径增大。

另外，对于4 种RES-SLN 制备方法的筛选中，最终制得的样品由于制备方式不同而造成最终体积有所差异。样品体积是否对于载药量、包封率及粒径造成影响尚需进一步实验进行讨论。

采用薄膜超声分散法所制备Res-SLN 载药量为24%，比现有文献中使用热高压均质法以及水性溶剂扩散法制得的同类制剂的载药量均有显著提高［6，11］。且处方中使用易挥发、毒性较小的无水乙醇:丙酮混合溶剂作为有机溶剂，与现有文献中多使用的乙酸乙酯或三氯甲烷比较［12］，本法使用的有机溶剂毒性更低、残留更少。

与现有文献已有处方和制法比较，本实验在SLN 制备中选择以泊洛沙姆188 ∶胆酸钠混合溶液作为水相表面活性剂，且加入卵磷脂作为油相的辅料，使得所制纳米粒的粒径减小、载药量提高。

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