HPLC 法同时测定银黄颗粒中6 个咖啡酰奎宁酸

史国生， 林永强， 徐丽华， 郭东晓

(山东省食品药品检验研究院，山东 济南250101)

银黄颗粒由金银花提取物和黄芩提取物组成，清热疏风、利咽解毒。用于外感风热、肺胃热盛所致的咽干、咽痛、喉核肿大、口渴、发热;急慢性扁桃体炎、急慢性咽炎、上呼吸道感染见上述证候者。现收载于《中国药典》2010 年版第一增补本［1］，含量测定项为HPLC 法测定金银花提取物中绿原酸的量和黄芩提取物中黄芩苷的量。据文献报道，绿原酸为多种植物共有成分，从菊花［2］、杜仲叶［3］、苎麻叶［4］，甚至葵花籽粕［5］和烟草废弃物［6］中都可以提取并分离得到绿原酸，因此仅依据绿原酸的量难以监督和控制金银花提取物的投料。

咖啡酰奎宁酸(caffeoyl quinic acids)类成分为金银花中的一类非常重要的活性成分，在金银花药材及其制剂中发现的这类化合物主要有6 个:3-O-咖啡酰奎宁酸、绿原酸(5-O-咖啡酰奎宁酸)、4-O-咖啡酰奎宁酸、4，5-O-二咖啡酰奎宁酸、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸、3，4-O-二咖啡酰奎宁酸［7］。马双成等［8］对金银花药材中的6 个咖啡酰奎宁酸进行了定量研究，本课题组曾对银黄片［9］和银黄含片［10］中上述成分的量进行测定。参考相关文献［8-14］，本研究对银黄颗粒中6 个咖啡酰奎宁酸同时定量测定，为银黄颗粒中金银花提取物的多成分质量控制提供了数据支持。此外， 《中国药典》2010 年版银黄颗粒项下只收载了两个规格，根据辅料、制成总量和每袋装量的不同，本实验收集到银黄颗粒共有5 个规格，本研究也为不同规格银黄颗粒中成分含有量限度的统一提供了依据。

1 仪器与试药

Agilent 1200 高效液相色谱仪(包括G1322A脱气机，G1311A 四元泵，G1329A 自动进样器，G1316A 柱温箱，G1314B VWD 检测器，ChemStation 工作站);Sartorius CP225D 电子天平(德国赛多利斯集团);绿原酸(5-O-咖啡酰奎宁酸)，批号110753-201314，购自中国食品药品检定研究院;3-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、4，5-O-二咖啡酰奎宁酸、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸、3，4-O-二咖啡酰奎宁酸，批号分别为ps100603-07、ps100512-06、ps100623-01、ps100623-02、ps100623-03，均 购自成都普思生物科技有限公司，纯度≥98%;甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯。银黄颗粒收集自20家生产企业，共26 批。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、4，5-O-二咖啡酰奎宁酸、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸、3，4-O-二咖啡酰奎宁酸对照品适量，加50%甲醇制成质量浓度分别为0.393 2、0.865 5、0.421 2、0.410 0、0.413 6、0.397 2 mg/mL 的对照品贮备液。分别精密量取上述对照品贮备液各3、5、3、3、3、5 mL，置同一100 mL 棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液，上述6 种成分依次为11.80、43.28、12.64、12.30、12.41、19.86 μg/mL。

2.1.2 供试品溶液的制备 取供试品适量，研细，取适量(相当于绿原酸0.8 mg)，精密称定，置50 mL 棕色量瓶中，加50%甲醇40 mL，超声(500 W，40 kHz)处理30 min，放冷，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性对照溶液的制备 取除金银花提取物以外的其他药味，照处方的组成和比例制成不加金银花提取物的阴性对照样品，并按“2.1.2”项下方法制成阴性对照溶液。

2.2 色谱条件及系统适用性试验 Kromasil C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);以乙腈为流动相A，以0.4% 磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱(0 ～15 min，5%A→20%A;15 ～30 min，20%A→30% A;30 ～45 min，30% A);体积流量1.0 mL/min;检测波长327 nm;柱温35 ℃;对照品进样量10 μL，样品为20 μL。在上述色谱条件下，6种成分的对称因子均在0.95 ～1.05 范围内，与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论板数均大于8 000。样品中其他成分对6 种待测成分的测定没有干扰。色谱图见图1。

2.3 方法学

2.3.1 线性关系考察 精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液各1、3、6、9、12、16、18、20 μL，按“2.2”项下色谱条件进行测定，以进样量X (μg)为横坐标，峰面积Y 为纵坐标进行线性回归。结果在相应进样量范围内，6 种成分线性关系良好，结果见表1。

2.3.2 精密度试验 精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液10 μL，连续进样6 次，结果3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、4，5-O-二咖啡酰奎宁酸、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸、3，4-O-二咖啡酰奎宁酸峰面积的RSD 分别为0.1%、0.1%、0.1%、0.2%、0.1%、0.1%。表明仪器的精密度良好。

图1 混合对照品(A)、供试品(B)和阴性对照(C)HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)，sample (B)，and negative sample (C)

表1 6 种成分线性关系测定结果Tab.1 Linearity of six components

2.3.3 稳定性试验 取同一供试品溶液于0、5、10、15、20、25 h 分别进样20 μL，结果3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、4，5-O-二咖啡酰奎宁酸、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸、3，4-O-二咖啡酰奎宁酸峰面积的RSD 分别为0.6%、0.2%、0.2%、0.4%、0.1%、0.2%。表明供试品溶液中的6 个待测成分在室温放置25 h内基本稳定。

2.3.4 重复性试验 取同一批银黄颗粒(批号120701)，按照“2.1.2”项下方法，平行制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下进样20 μL 进行测定并计算，结果3-O-咖啡酰奎宁酸平均含有量为1.145 mg/g，RSD 为0.4%;5-O-咖啡酰奎宁酸平均含有量为3.751 mg/g，RSD 为0.2%;4-O-咖啡酰奎宁酸平均含有量为1.510 mg/g，RSD 为0.2%;4，5-O-二咖啡酰奎宁酸平均含有量为1.653 mg/g，RSD 为1.2%;3，5-O-二咖啡酰奎宁酸平均含有量为1.109 mg/g，RSD 为0.7%;3，4-O-二咖啡酰奎宁酸平均含有量为2.011 mg/g，RSD 为0.2%。结果表明其重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验 取“2.3.4”项下已测定的银黄颗粒粉末0.1 g，精密称定，共取6 份，置50 mL 量瓶中，精密加入“2.1.1”项下的混合对照品溶液10 mL (3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、4，5-O-二咖啡酰奎宁酸、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸、3，4-O-二咖啡酰奎宁酸质量浓度分别为 11.80、43.28、12.64、12.30、12.41、19.86 μg/mL)，加50% 甲醇30 mL，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，进样20 μL 进行测定。结果3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、4，5-O-二咖啡酰奎宁酸、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸、3，4-O-二咖啡酰奎宁酸的平均回收率(n =6)分别为96.2%、96.8%、 96.2%、 104.9%、 96.8%、 95.9%;RSD 分 别 为 0.6%、0.5%、1.3%、0.4%、0.2%、0.3%。

2.4 样品测定 取不同厂家银黄颗粒样品共26 批，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样20 μL 进行测定，计算，结果见表2。

3 讨论

3.1 提取溶剂的选择 分别以甲醇、50%甲醇和水为提取溶剂，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，结果50% 甲醇提取效率最高，故选择50%甲醇作为提取溶剂。

3.2 提取方法和时间的选择 以50%甲醇为溶剂，对超声15、30、45 min 及加热回流0.5、1 h进行考察。实验结果表明，超声30、45 min 及加热回流0.5 h、1 h 效果相当，而超声比加热回流操作简便，故确定采用超声30 min 进行提取。

表2 26 批银黄颗粒中6 种咖啡酰奎宁酸的测定结果Tab.2 Determination of six caffeoyl quinic acids in 26 batches of Yinhuang Granules

3.3 取样量的考察 分别取相当于绿原酸0.4、0.8、1.6 mg 的样品，精密称定，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液。前两种取样量的测定结果没有显著差异，而取样量相当于绿原酸1.6 mg时，测定结果稍低，此外考虑到取样的均匀性，选择相当于绿原酸0.8 mg 的取样量。

3.4 检测波长的选择 经紫外光谱测定，6 个咖啡酰奎宁酸类成分在(327 ±2)nm 处均有最大吸收峰［15］，故选择以327 nm 作为检测波长。

3.5 检测结果的分析 根据辅料、制成总量和每袋装量的不同，收集到的银黄颗粒共有5 种规格:(1)每袋装4 g、(2)每袋装8 g、(3)每袋装2 g(无蔗糖，制成总量300 g)、(4)每袋装4 g (无蔗糖，制成总量300 g)和(5)每袋装4 g (无蔗糖，制成总量600 g)。《中国药典》2010 年版第一增补本仅收载了规格(1)和(3)，每袋含绿原酸量均规定为13.6 ～18.4 mg。

由于规格(1)、 (3)和(5)每次服用1 ～2袋，规格(2)和(4)每次服用0.5 ～1 袋，5 种规格的单次服用量按金银花提取物折算相同。将不同规格的银黄颗粒按单次服用量统一折算，26 批样品的绿原酸和总咖啡酰奎宁酸的平均含有量分别为15.19、29.12 mg/袋。以《中国药典》限度范围的低限(13.6 mg)相对于绿原酸平均含有量(15.19 mg/袋)的百分比，折算总咖啡酰奎宁酸的含有量低限，建议规定总咖啡酰奎宁酸不得少于26.1 mg/袋。

由于《中国药典》对绿原酸量进行了规定，26 批样品的绿原酸含有量差别不大，但其他5 个咖啡酰奎宁酸含有量差异较大，不同生产企业之间差异尤为显著，表明各企业使用的金银花提取物质量参差不齐，有必要对6 个咖啡酰奎宁酸同时进行测定，以规范和控制银黄颗粒及其原料金银花提取物的质量。

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