shRNA抑制survivin基因表达对脐静脉血管内皮细胞增殖与凋亡的影响*

马 莎,林 俊,晋 松,李 芹,张 虹,王 静

(云南省第一人民医院风湿免疫科,昆明 650032)

论著·基础研究

shRNA抑制survivin基因表达对脐静脉血管内皮细胞增殖与凋亡的影响*

马 莎,林 俊△,晋 松,李 芹,张 虹,王 静

(云南省第一人民医院风湿免疫科,昆明 650032)

目的 研究靶向存活素(survivin)的短发夹RNA真核表达质粒(shRNA)对脐静脉血管内皮细胞增殖与凋亡的影响。方法合成靶向survivin的shRNA真核表达质粒及阴性对照质粒，用脂质体法将质粒转染至经VEGF(50 ng/mL)处理的HUVEC细胞；转染48 h后，采用实时定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白印迹法检测HUVEC中survivin的mRNA表达及蛋白水平。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖；TUNEL法检测细胞凋亡。结果(1)survivin-shRNA质粒试验组与阴性对照shRNA质粒组及空白对照组比较，转染48 h后人脐静脉血管内皮细胞survivin的mRNA及蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。(2)与阴性对照shRNA组及空白对照组比较，转染后的人脐静脉血管内皮细胞增殖能力明显下降。转染后24、48、72 h生长抑制率分别为(13.53±3.91)%、(38.97±1.82)%、(65.75±1.83)%，于转染后72 h最为显著。(3)试验组凋亡率为(28.07±1.71)%，较阴性对照组(11.45±1.52)%和空白对照组(10.04±1.46)%显著增高(P<0.05)。结论靶向survivin的shRNA质粒能通过下调survivin表达，进而抑制人脐静脉血管内皮细胞增殖并促进其凋亡。

血管内皮生长因子；存活素；shRNA；增殖；细胞凋亡

存活素(survivin)是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis of protein,IAP)家族成员，是具有强大抗凋亡效应的蛋白[1]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEFG)可诱导survivin抗凋亡蛋白的表达，抑制内皮细胞凋亡,促进血管生成[2]。深入认识和揭示survivin在介导VEGF促血管新生中的作用对寻找类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的基因靶向治疗的方法具有重要意义。本试验旨在通过转染survivin-短发夹RNA真核表达质料(shRNA)至人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)，观察抑制survivin对外源性VEGF处理后HUVEC增殖及凋亡的影响，为RA基因靶向治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料 人脐静脉血管内皮细胞(凯基生物公司)，VEGF165(美国Peprotech公司)，澳洲胎牛血清FBS、RPMI-1640培养基(Gibco公司)，四甲基偶氮唑蓝(MTT)、DMSO(Sigma公司)，survivin兔抗人单克隆抗体(Abcam公司)，GAPDH鼠抗人单克隆抗体(上海Abmart公司)，SYBR Green Master(Roch公司)、Lipofectamine2000(Invitrogen公司)，shRNA-survivin表达质粒载体及阴性对照质粒载体(吉凯基因技术公司)，实时荧光定量PCR引物(Invitrogen公司)，蛋白浓度测定试剂盒、TUNEL细胞凋亡检测显色法试剂盒(碧云天生物技术公司)。

1.2 方法

1.2.1 外源性VEGF处理HUVEC HUVEC细胞系采用含10%FBS的RPMI-1640完全培养基加双抗，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中。细胞生长密度至85%～90%，按1∶2比例进行传代。转染前24 h选择对数生长期HUVECs细胞，按照6×105/孔接种至6孔板，每孔使用2 mL不含抗菌药物的完全培养基，加入VEGF使其终浓度为50 ng/mL[3]，继续培养24 h。

1.2.2 shRNA载体转染HUVEC 经VEGF处理细胞24 h后将VEGF培养基弃去，PBS润洗3次，每孔加入2 mL不含抗菌药物完全培养基，设空白对照组(加入RPMI-1640培养基)、阴性对照组(加入negative-shRNA)、试验组(加入survivin-shRNA)，靶序列为5′-AGA ATT AAC CCT TGG TGA A-3′，按照Lipofectamine 2000说明书进行，转染48 h后在荧光显微镜下观察细胞，呈GPF绿色荧光的细胞为转染阳性细胞，计数4个高倍视野，转染效率=阳性细胞数/总的细胞数×100%，根据转染效率优化转染条件。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测HUVEC中survivin mRNA表达 转染48 h后收集细胞，用Trizol法提取细胞总RNA，按试剂盒说明书合成cDNA。以cDNA作为模板，采用SYBR荧光染料法进行实时定量PCR检测各组mRNA表达，反应体系为25 μL,每个样品分别设计3个重复。survivin上游引物：5′-GAC CAC CGC ATC TCT ACA TTC-3′，下游引物5′-TGC TTT TTA TGT TCC TCT ATG GG-3′；GAPDH的上游引物：5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′，下游引物：5′-CCA CCA CCC TGT TGC TGT AG-3′；实时定量PCR仪循环设置：95 ℃ 10 min预变性，95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，进行40个循环。用相对定量方法2-△△Ct值表示目的基因的mRNA水平[4]。

1.2.4 Western印迹法检测survivin蛋白表达水平 转染48 h后收集细胞并提取蛋白，BCA法测蛋白浓度。用15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离胶进行电泳分离，并转移至PVDF膜，用5%的脱脂奶粉封闭1 h，孵育survivin一抗(1∶2 000稀释)和内参GAPDH一抗(1∶10 000稀释)，4 ℃过夜。TBST洗膜，用特异性辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶7 000稀释)室温孵育1 h，TBST洗膜，显色并于暗室曝光。Bio-Rad凝胶成像分析系统对电泳条带进行密度扫描，用Scion-Image软件对图像进行分析，测目的蛋白和内参GAPDH蛋白的电泳条灰度值，以二者比值代表目的蛋白相对表达量。

1.2.5 MTT法检测抑制survivin表达对HUVEC细胞增殖的影响 取对数生长期的HUVEC细胞，转染前24 h按5×103个/孔细胞接种至96孔板，其后按上述分组及96孔板说明参数进行转染，转染6 h后更换完全培养基，培养24、48、72 h后每孔加入浓度为5 mg/mL的MTT 30 μL，37 ℃作用4 h，PBS洗涤2次，每孔加入150 μL DMSO，室温避光振荡15 min使结晶充分溶解。在酶标仪测定490 nm波长下的吸光度(A)值。细胞生长抑制率(%)=(1-试验组A值/空白对照组A值)×100%。

1.2.6 细胞凋亡分析 采用TUNEL法检测细胞凋亡。接种细胞至爬片后按上述方法转染及分组，培养48 h后收集细胞爬片，按说明书进行操作，细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。每张爬片计数5个高倍镜视野(×400)中的凋亡阳性细胞核数和总的细胞核数，凋亡率=阳性细胞核数/总的细胞核数计算细胞×100%，取其平均值。

2 结 果

2.1 观察转染48 h后GFP绿色荧光标记细胞阳性率 观察转染48 h后HUVECs中GFP绿色荧光标记细胞阳性率，通过优化转染条件，发现当培养基中质粒浓度为1.5 μg/mL时可获得最佳的转染效率，转染效率达到70%以上，见图1。

A、B：试验组；C、D：阴性对照组。

图1 转染48 h后试验组与阴性对照组细胞(倒置相差显微镜，×200)

表1 转染48 h后各组检测结果比较

2.2 实时荧光定量PCR检测survivin mRNA的表达 转染48 h后试验组、阴性对照组、空白对照组survivin mRNA相对表达量见表1，试验组显著低于空白对照组和阴性对照组(P<0.01);阴性对照组与空白对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 Western blot检测survivin蛋白的表达 转染48 h后空白对照组、阴性对照组、试验组survivin蛋白表达情况见图2，相对表达量见表1。试验组survivin蛋白表达量显著低于空白对照组和阴性对照组(P<0.01)，表达抑制率为56.7%;阴性对照组和空白对照组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 MTT法检测各组细胞增殖活性结果 转染24、48、72 h后各组A值见表2，实验组细胞生长速度较空白对照组和阴性对照组均有不同程度减慢(P<0.01)，生长抑制率分别为(13.53±3.91)%、(38.97±1.82)%、(65.75±1.83)%，而阴性对照组与空白对照组细胞生长抑制率比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图2 各组HUVEC细胞survivin的蛋白表达量

表2 各组HUVEC细胞不同转染时间MTT实验检测的A值比较

2.5 survivin-shRNA干扰HUVEC细胞后对其凋亡的影响 转染48 h后，试验组细胞凋亡率为(28.07±1.71)%，与空白对照组(10.04±1.46)%和阴性对照组(11.45±1.52)%比较，试验组细胞凋亡率明显增加(F=164.32，P<0.01)。而阴性对照组与空白对照组间细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

血管翳是RA病变过程中一个特征性的病理表现，新生血管形成在RA的侵蚀和破坏过程中发挥了重要的作用并贯穿整个病程[5]。VEGF被认为是血管新生过程中的核心因子，其通过增加血管内皮细胞有丝分裂，促进新生血管形成，并增加血管通透性及炎性物质渗出，促进炎症形成与发展[6]。VEGF及其受体在RA动物模型及RA患者的滑膜组织及血清中均高表达[7]。体外试验也证明了关节炎的滑膜细胞能够分泌较高水平的VEGF[8]。RA血清VEGF水平与疾病严重程度及并发症的出现存在相关性[9]，同时抑制血管生成的药物可有效缓解RA的病情[10]，腺病毒介导的反义VEGF基因转染可有效减轻胶原关节炎症状，减轻滑膜血管翳对关节软骨的破坏和病理改变[11]。然而，VEGF作为具有重要生理功能的细胞因子，抑制其表达也将带来新的健康问题[12]。

survivin是IAP家族具有强大凋亡抑制效应的蛋白，survivin可以与VEGF相互作用，在VEGF诱导下，内皮细胞中survivin表达增强，抑制内皮细胞凋亡,促进血管生成[13]。survivin表达异常增高则促进VEGF诱导的内皮细胞增殖和三维毛细血管网的形成[12]。采用反义技术使内皮细胞survivin表达缺失，可抑制VEGF介导的内皮细胞保护作用，促进内皮细胞的凋亡和血管的退行性变，进而阻抑血管新生[3]。研究表明survivin在常见恶性肿瘤中表达，而在正常成熟的细胞和组织中无表达，这些研究使得通过抑制survivin表达来调控血管新生过程在治疗RA成为可能。

本试验通过VEGF处理HUVEC促进细胞增殖及上调survivin表达而模拟体外类风湿关节炎滑膜组织中血管新生状态，构建靶向survivin的shRNA质粒载体转染经外源性重组VEGF165处理的脐静脉血管内皮细胞。转染48 h后HUVEC中survivin的mRNA及蛋白表达水平明显下降，试验组mRNA相对表达量分别为(27.67±3.51)%，蛋白的相对表达量为0.74±0.05，表达抑制率为56.7%，显著低于阴性对照组与空白对照组(P<0.01)，说明在一定程度上survivin-shRNA实现了对人脐静脉血管内皮细胞survivin基因的沉默，而阴性对照组shRNA对survivin的表达无影响。MTT法检测细胞的增殖效应发现转染后试验组细胞增殖的抑制于转染48 h后出现，随着时间的增加抑制效应递增，72 h抑制达到高峰，生长抑制率为(65.75±1.83)%，实现了对HUVEC增殖的下调。转染48 h后试验组凋亡率为(28.07±1.71)%，较阴性对照组和空白对照组显著增加(P<0.05)，证明下调survivin基因的表达可促进HUVEC细胞凋亡。

综上所述，通过抑制人脐静脉血管内皮细胞中survivin的表达可减少外源性VEGF促血管内皮细胞增殖作用并促进细胞凋亡，推测survivin参与介导VEGF促血管生成过程，与Mesri等[3]的研究结果一致。提示在RA中抑制survivin基因的表达将在抑制类风湿关节炎滑膜血管翳形成方面发挥作用，对RA有潜在的治疗价值。下一步将借助survivin-shRNA载体上携带的抗性标记筛选出稳定转染的阳性HUVEC细胞，研究其在更长时间范围的细胞生长特性及炎性因子分泌情况，为RA基因靶向治疗奠定基础。

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Effects of shRNA-mediated survivin silencing on proliferation and apoptosis of human umbilical vein endothelial cells*

MaSha，LinJun△，JinSong，LiQin，ZhangHong，WangJing

(DepartmentofRheumatoidandImmunology,theFirstPeople′sHospitalofYunnanProvince，Kunming,Yunnan650032，China)

Objective To investigate the effect of short hairpin RNA(shRNA) eukaryotic expression vector-mediated silencing of the survivin-gene on proliferation and apoptosis of human umbilical vein endothelial cells(HUVEC).MethodsThe shRNA vector targeting the survivin gene and negative control vector were transfected into human umbilical vein endothelial cells(HUVEC) incubated with 50 ng/mL of recombinant VEGF in vitro by lipofectamine 2000.Transfection after 48 h,the expression of survivin mRNA and protein was detected by quantitative real-time PCR and Western blot,respectively.HUVEC proliferation was assayed by four methylthiazolyl tetrazolium(MTT) and cell apoptosis was detected by TUNEL.Results(1)Transfection with survivin-shRNA vector significantly down-regulated the expression of survivin mRNA and protein as compared with the control group,after transfection of 48 h(P<0.05).(2)After survivin-shRNA vector transfected,the proliferation of HUVEC decreased significantly.After transfection 24,48,72 h,the growth inhibition rate were (13.53±3.91)%,(38.97±1.82)%,(65.75±1.83)% respectively,at 72 hours after transfection was the most significant.(3)The apoptosis rate of experimental group was (28.07±1.71)%,which was higher than the negative control group (11.45±1.52)% and blank control group (10.04±1.46)% (P<0.05).ConclusionThe shRNA-mediated mediated silencing of the survivin-gene could significantly inhibit proliferation and promote the apoptosis of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts by regulating survivin expression．

vascular endothelial growth factor;survivin;short hairpin RNA;proliferation;apoptosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.35.008

云南省科技厅昆明医科大学联合专项基金资助项目(2011FB215)。

：马莎(1982-)，主治医师，硕士，主要从事类风湿关节炎的基础研究。△

，Tel：13888906672；E-mail：linjun06@sina.com。

R593.22

A

1671-8348(2015)35-4922-03

2015-05-15

2015-07-22)