类芽孢杆菌BD3526 抑菌活性物质的初步分离及性质测定

刘玉娟，韩 瑨，吴 江，刘振民，郭本恒，吴正钧*

1乳业生物技术国家重点实验室 光明乳业股份有限公司，上海 200436;2 上海海洋大学食品学院，上海 201306

类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)细菌是广泛存在于自然界，好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌，其生理特性丰富多样，是土壤和植物微生态优势种群之一。类芽孢杆菌原属于芽孢杆菌属，1994 年Ash 等［1］基于分子生物学的研究结果，将其从芽孢杆菌属中独立出来，成立类芽孢杆菌属。类芽孢杆菌属的菌株在生长过程中，能产生耐热抗逆的芽孢，有利于其在环境中存活、定殖与繁殖，在产品开发中因较非芽孢杆菌属细菌有效活菌数量高、性能稳定等优势而备受瞩目，是芽孢杆菌中比较具有应用潜力的菌种之一［2］。其中某些菌株也是重要的植物生防细菌和植物根际促生菌，并且在农业领域已得到广泛的应用［3］。

类芽孢杆菌中的某些菌株，在代谢过程中可产生如多糖、酶、拮抗蛋白、抗生素、植物激素、絮凝剂等多种生物活性物质［4］，这些活性物质在环境治理、植物病害防治以及畜牧业方面具有诱人的应用前景。在其产生的抑菌物质中，最主要的是多粘菌素(polymyxin)，它是由多种氨基酸和脂肪酸组成的碱性脂肽类抗生素，有A、B、C、D、E 五中类型，分子量都在1200 Da 左右，对G-菌有明显抑制作用［5］。目前研究较多的是多粘菌素B，它除了对G-菌有明显杀菌作用外，还能对其产生的内毒素有一定的抑制作用，但由于其本身的肾毒性和神经毒性，一度限制了它在临床上的应用［6］。还有一类尚未统一命名，它们都含有一个稀有脂肪酸侧链，即15-胍基-3-羟基十五烷酸(GHPD)，这类物质主要包括gatavalin，fusaricidins A、B、C、D 或LI-F 系列抗生素［7］，分子量大都是900 Da 左右，对白色念珠菌、酿酒酵母菌、黑曲霉、米曲霉、尖孢镰刀菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌等具有很好的拮抗作用。

本文对Paenibacillus sp.BD3526 产生的类细菌素抗菌物质进行了研究，为今后该菌在医药、食品和饲料加工等领域的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种

本实验所用拮抗菌为Paenibacillus sp.BD3526(CGMCC 8333=DSM 28815)，是从西藏地区耗牛奶中分离得到。指示菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CGMCC1.879，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)CGMCC1.1848，单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)CGMCC1.9136，均由乳业生物技术国家重点实验室提供。

1.1.2 培养基

TYC 培养基(g/L;酪朊水解物15 g，酵母抽提物5 g，蔗糖50 g，无水乙酸钠20 g，NaCl 1 g，NaHCO32 g，无水Na2SO40.1 g，L-胱 氨 酸0.2 g，Na2HPO4·12H2O 2 g);营养肉汤(g/L;蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g)，固体培养基加入1.2%的琼脂，培养基121 ℃高压灭菌15 min 后备用。

1.1.3 酶的品种及编号

胰蛋白酶(1800 U/mg，Sigma，CAS:9002-07-7)，胃蛋白酶(427 U/mg，Sigma，CAS:9001-75-6)，脂肪酶(400 U/mg，Sigma，CAS:9001-62-1)，蛋白酶K(30 U/mg，Sigma，CAS:39450-01-6)，链霉蛋白酶(3.5 U/mg，Sigma，CAS:9036-06-0)。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种的培养

拮抗菌株的培养:将预先保藏的菌种BD3526接种至TYC 固体平板上，30 ℃培养3 d，菌种活化两代备用。指示菌的培养:指示菌接种于LB 固体平板上，37 ℃培养24 h，挑取单菌落于15 mL 营养肉汤中，37 ℃，180 rpm，培养20 h，菌液稀释备用。

1.2.2 抑菌活性的测定

采用点种法［8］。培养好的指示菌菌液，与营养琼脂混合均匀，使最终指示菌浓度为105cfu/mL，将培养基倒入平板中，待其表面水分蒸发完全后，吸取10 μL 待测样品滴加在指示菌平板上，37 ℃培养24 h，观察结果。根据抑菌圈的大小判断样品活性强弱。

1.2.3 MIC 的测定

最低抑菌浓度是衡量抑菌物质性能的一个关键指标。本实验采用倍半稀释法对待测样品进行稀释，将样品稀释到原溶液浓度的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32，分别滴加到指示菌平板上，观察抑菌圈的出现情况，能抑制培养基内指示菌生长的最低浓度则为该样品的MIC 值［9］。

1.2.4 抑菌率的测定

无菌96 孔板中依次加入50 μL 初步纯化样品、180 μL LB 培养基、20 μL 指示菌菌液，使最终样品孔中菌浓为105cfu/mL，以无菌水代替样品作为对照。混匀后置于37 ℃恒温培养箱中培养，每隔1 h用酶标仪(Spectra M5，Molecular Devices)测定OD600值［10］，共测量18 h。抑菌率按下式计算:

式中，A 为对照组OD600值，A1 为样品组OD600值。

1.2.5 样品的纯化

将平板上菌体刮下，加入丙酮浸提1 h，连续浸提3 次，将3 次浸提液合并，9000 rpm，10 min，4 ℃离心取上清，去除有机溶剂，真空冻干，得到含有抑菌活性物的粗品。冻干后的粗品用甲醇复溶配成浓度为100 mg/mL 的溶液，经0.22 μm 微孔滤膜过滤后，通过Sephadex LH-20 分离，甲醇洗脱，流速为0.6 mL/min，每150 s 收集一管，共收集2 个柱体积。分别检测各管抑菌活性，收集活性组分。

1.2.6 热稳定性测定

将初步纯化的样品用纯水配成2 mg/mL 溶液，分别吸取0.5 mL 样品，置于50、60、70、80、90 ℃水浴中保温2 h，沸水浴15 min，121 ℃条件下处理5 min，以未经热处理的样品作对照，检测抑菌活性。实验设三个平行，并比较组间差异性大小。

1.2.7 pH 适用范围的测定

称取初步纯化样品0.5 mg，分别溶解在pH 3、pH 4、pH 5、pH 6、pH 7、pH 8、pH 9、pH 10 的磷酸盐缓冲溶液中，配成浓度为2 mg/mL 的溶液，检测抑菌活性，以pH 7 样品作对照，比较不同pH 条件下抑菌圈大小。实验设三个平行，取平均值比较差异性大小。

1.2.8 蛋白酶敏感性测定

4 mg/mL 样品溶液分别调节至各酶的最适pH，以1∶3 的比例将酶与样品溶液混合，使酶最终浓度为1 mg/mL，将混合液在37 ℃水浴中保温2 h，调节pH 至中性，以加入同等体积的磷酸盐缓冲溶液样品作为对照，检测抑菌活性［11］。

1.2.9 统计学分析

采用SPSS 21.0 统计软件处理实验数据，单因素方差分析进行显著性实验，并用LSD-t 进行组间差异性比较，P＜0.05 表示差异显著具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 样品的纯化

微生物代谢产物大部分是分泌到周围环境中，但也有少数物质是粘附在菌体表面［12］。Paenibacillus sp.BD3526 在发酵过程中，已经证实其产生的抑菌活性物质，既粘附在菌体表面，也分泌到周围环境中。实验初期阶段，以菌体发酵液为研究对象，对抑菌物质进行分离纯化，由于在发酵过程中，受温度、时间、通氧量等影响，检测到抑菌活性不稳定。所以粗提物的制备直接选用菌体，经有机溶剂浸提，再减压去除溶剂后，冷冻干燥，得到抑菌活性物质粗品C。

粗品C 甲醇复溶通过Sephadex LH-20 分离，洗脱曲线见图1，其中第72 管至78 管，即洗脱体积为柱体积的3/5～4/5 时，活性组分流出。为了尽量减少杂质的带入，获得较高纯度的目的物质，选择73、74、75、76、77 五管合并，作为初步纯化后活性组分P。

图1 Sephadex LH-20 洗脱曲线Fig.1 Elution chromatogram of the antimicrobial components of BD3526 on Sephadex LH20

2.2 MIC 的测定

抑菌物质粗品C 纯水复溶，倍半稀释法配成以下浓度:200、100、50、25、12.5、6.25 mg/mL;Sephadex LH-20 初步纯化后的抑菌物质活性组分P 纯水复溶，倍半稀释法配成以下浓度:8、4、2、1、0.5、0.25 mg/mL，以金黄色葡萄球菌CGMCC1.879，藤黄微球菌CGMCC1.1848，单增李斯特菌CGMCC1.9136 为指示菌检测抑菌活性，结果见表1 和表2。由表1和表2 可知，粗品浓度为12.5 mg/mL，Sephadex LH-20 纯化样品浓度为1 mg/mL 时，藤黄微球菌CGMCC1.1848 未有长出;粗品浓度为25 mg/mL，SephadexLH-20 纯化样品浓度为2 mg/mL 时，金黄色葡萄球菌CGMCC1.879 和单增李斯特菌CGMCC1.9136未有长出，由此得出，粗品对藤黄微球菌CGMCC1.1848 的MIC 是12.5 mg/mL，对金黄色葡萄球菌CGMCC1.879 和单增李斯特菌CGMCC1.9136 的MIC 值为25 mg/mL;Sephadex LH-20 纯化样品对藤黄微球菌CGMCC1.1848 的MIC 是1 mg/mL，对金黄色葡萄球菌CGMCC1.879 和单增李斯特菌CGMCC1.9136 的MIC 值为2 mg/mL。经过SephadexLH-20 分离，样品的MIC 值缩小了12.5 倍，表明样品得到了有效的纯化。

表1 粗品各浓度抑菌活性Table 1 Antimicrobial activity of crude extracts with different concentrations

表2 Sephadex LH-20 纯化样品各浓度抑菌活性Table 2 Antimicrobial activity of purified fraction in different concentrations

同时，由以上数据可知，藤黄微球菌CGMCC1.1848 的MIC 值明显低于金黄色葡萄球菌CGMCC1.879 和单增李斯特菌CGMCC1.9136 的MIC 值，故在测定抑菌物质的性质时，选择敏感性较高的藤黄微球菌CGMCC1.1848 作为指示菌。

2.3 热稳定性测定

初步纯化样品P 经不同温度处理后，样品抑菌圈直径平均值见图2。经SPSS 21.0 分析，组间比较，与未经热处理的样品相比，50、60、70、80、90、100、121 ℃处理后样品活性均没有显著性差异(P ＞0.05)，结果表明该样品有良好的热稳定性。

2.4 pH 适用范围的测定

图2 不同温度处理后样品抑菌圈直径Fig.2 Diameter of inhibition zone with different heat treatments

不同pH 值条件下，样品抑菌圈直径平均值见表3。选择pH7 条件下抑菌圈直径做对照，以其他pH 值条件下抑菌圈直径和其差值为纵坐标作图，结果见图3，由图可知，在pH 小于7 的情况下，抑菌圈的直径随着酸性的增强而减小，表明在酸性条件下，抑菌活性会受到一定抑制，pH 在7～9 范围内，抑菌圈直径增大，说明抑菌物质活性增强，pH 大于9 时，与对照组相比，抑菌圈直径减小，活性有所减弱。由此可见，该抑菌活性物质在偏碱性条件下，抑菌作用最强。

表3 不同pH 条件下样品抑菌圈直径Table 3 Inhibition diameter with different pH values

图3 不同pH 条件下抑菌圈直径的比较Fig.3 Comparison of inhibition diameter with different pH values

2.5 蛋白酶敏感性测定

初步纯化样品P，经不同酶处理后各样品活性见下图，由图4 可知，样品经胰蛋白酶、胃蛋白酶、脂肪酶、蛋白酶K 处理后，活性没有明显变化，而经链霉蛋白酶处理后，活性基本消失。依据上述结果，进一步分析初步纯化样品P 在液体培养状态下，对藤黄微球菌CGMCC1.1848 的抑菌作用，结果见图5。在1 mg/mL 浓度下，初步纯化样品P 经链霉蛋白酶处理后，抑菌活性明显下降，在0～18 h 内，未经酶处理的初步纯化样品P 对藤黄微球菌CGMCC1.1848 的最高抑菌率为90.43%，而经链霉蛋白酶处理后样品最高抑菌率为17.45%。与链霉蛋白酶相比，其它酶类作用专一性强，有特异性水解位点，而链霉蛋白酶是一种肽酶，对作用位点肽键的氨基酸组成没有特定的选择性，结果表明活性组分可能是肽类物质。

图4 胰蛋白酶(A)、胃蛋白酶(B)、脂肪酶(C)、蛋白酶K(D)、链霉蛋白酶(E)处理后样品及对照组(F)的抑菌活性Fig.4 Antimicrobial activities of control (F)and samples digested by trypsin (A)，pepsin (B)，lipase (C)，protease K (D)，pronase (E)

图5 链霉蛋白酶处理前后样品抑菌率Fig.5 Inhibition rate of samples before and after digestion by pronase

3 结论

本实验以一株类芽孢杆菌BD3526 为研究对象，采用有机溶剂浸提菌体的方法，分离得到对G+菌有明显抑制作用的活性组分，并对其进行了初步的性质测定。经不同温度处理后，样品活性基本保持不变。酸碱适用范围实验表明，样品在酸性条件下，活性会受到些许抑制，在中性偏碱条件下，样品活性最高。样品经链霉蛋白酶处理后活性基本消失，表明该活性物质可能是肽类物质，这与文献报道基本一致［13，14］。

鉴于微生物在发酵过程中，受到影响因素较多，活性不稳定等问题，抑菌物质的提取可以以菌体作为介质，直接破碎细胞得到。经过实验验证，以菌体为介质，重现性较好，但样品组分较为复杂，为分离纯化增加了困难。本实验主要采用了凝胶层析获得了初步纯化的样品，但若想得到纯度较高的样品，作进一步的结构分析，则还需对样品进行纯化。

目前，乳酸链球菌素(Nisin)是唯一被批准应用在食品中的细菌素［15］，但其抑菌谱较窄，只对G+菌和部分芽孢菌有抑制作用，对G-菌没有作用，而且Nisin 只有在低酸条件下，才能发挥作用，在中性及偏碱性条件下，几乎全部失活［16］。本实验所用供试菌株BD3526，是从西藏耗牛奶中分离得到，该菌在血平板上未见溶血(数据未公开)，同时，目前已有多种(株)类芽孢作为益生菌在医药和畜牧养殖上应用，保证了菌种的安全性。因此，在食品、医药、环境工程等方面具有很高的应用潜力。

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