低温蛋白酶产生菌的筛选及其酶学性质的初步研究

莫清珊 ，张会图，田 耀，孙同韦，冯士元，孙 军，路福平

(1.天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2.天津科技大学海洋科学与工程学院，天津 300457)

低温蛋白酶是指最适催化温度在40,℃以下，并且在20～30,℃仍能保持较高酶活(50%以上)的一类蛋白水解酶[1].由于其最适催化温度接近自然环境中的温度，因此在应用过程中可省去加热或冷却过程，与中高温蛋白酶相比具有节能、省时等特点，在食品及洗涤行业具有广泛的应用前景.低温蛋白酶多数来源于冰川、极地、高山、深海等低温环境中的嗜低温或耐低温微生物[2–3].这些低温微生物为了适应其所处的低温环境，常可表达分泌一些在低温条件下仍具有较高催化活性的胞外酶或胞内酶，因此从耐低温或嗜低温微生物中筛选获得低温蛋白酶已成为发掘新型工业用低温酶制剂的主要方法[4].目前已发现的产低温蛋白酶菌株有来源于冰川冻土中的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和短小杆菌(Curtobacterium luteum)、来源于南极地区的梭状芽孢杆菌(Clostridium sp.)和嗜冷杆菌(Psychrobacter proteolyticus)、来源于海洋浮冰中的科尔韦尔氏菌属(Colwellia sp.)、来源于寒漠地区的微小杆菌(Exiguobacterium sp.)以及来源于其他寒冷环境中的沙雷氏菌(Serratia sp.)、弧菌(Vibrio sp.)、黄单胞菌(Xanthomonas maltophilia)、希瓦氏菌属(Shewanella sp.)产黄青霉(Penicillium chrysogenum)等.这些菌株所产低温蛋白酶的最适催化温度大部分均在30～40,℃，只有少数几种的最适催化温度低于20,℃，但稳定性很差.国内对低温蛋白酶及其产生菌的研究起步较晚，研究对象多集中在来源于冰川及冻土中的假单胞菌属 (Pseudomonas)、黄杆菌属(Xanthomonas)、产气单胞菌属(Aeromonas)等.本研究则从深海沉积物中分离到1 株产低温蛋白酶动性球菌(Planococcus sp.)，并对该菌株的生长特性、产酶特性及其所产蛋白酶的酶学性质进行了研究.

1 材料与方法

1.1 菌株来源

嗜冷菌株由天津科技大学孙军教授提供的南印度洋的深海沉积物中分离得到.

1.2 主要试剂和仪器

连接酶、Taq DNA 聚合酶、dNTP、T 载体、DNA Marker，宝生物工程(大连)有限公司；酪蛋白、琼脂粉、缓冲液试剂，上海生工生物工程有限公司.

PCR 仪、凝胶成像仪、电泳系统，美国Bio-Rad公司；1500–201 型全波长酶标仪，美国热电公司.

1.3 培养基

酪蛋白筛选培养基：酪蛋白20,g，琼脂15,g，人工海水定容到1,L，调节pH 到7.5～8.0.

发酵培养基：ZoBell 2216E 培养基.

1.4 产低温蛋白酶菌株的分离与鉴定

1.4.1 产低温蛋白酶菌株的分离

取深海沉积物样品1,g，加入20,mL 生理盐水，涡旋振荡混匀.按10 倍稀释法稀释成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-76 个稀释度的稀释液，每个稀释度各取0.2,mL 稀释液涂布于3 个酪蛋白筛选培养基平板上，并分别于4、20、25,℃培养72,h.选取菌落周围有明显蛋白水解圈的菌落于酪蛋白分离培养平板上进行三区划线纯化培养.根据水解圈直径dH与菌落直径dc的比值确定菌株低温条件下产蛋白酶能力的大小.

1.4.2 16S,rDNA 的克隆及系统进化分析

菌体基因组提取参照文献[5]进行；以上述基因组为模板，以细菌 16S rDNA 通用引物 27,F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')，1492,R(5'-AGT AAGGAGGTGATCCAACCGCA-3')对16S rDNA 进行PCR 扩增.PCR 反应条件为：94,℃预变性5,min，然后94,℃ 60,s，55,℃ 90,s，72,℃ 120,s，循环30 次，72,℃ 延伸10,min.扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳回收后克隆至T 载体，并委托北京华大基因公司测序.将所得序列在NCBI 网站进行 Blastn 比对(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，确定与其相关的种属特性.

1.4.3 菌株形态及生理生化特性鉴定

最适生长温度、菌落形态、革兰氏染色、氧化酶活性检测、过氧化氢酶活性检测、明胶液化实验参照文献[6]进行.

1.5 蛋白酶粗酶液的制备及酶活测定

将种子培养液以2%的体积比接种至50,mL 发酵培养基，分别在不同温度下(15、20、25,℃)，200,r/min振荡培养52,h，定时取样，考察不同培养温度对产酶的影响.

收集菌液于4,℃、10,000,r/min 离心30,min，收集上清液.

以酪蛋白为底物的酶活的测定方法参照文献[7]进行；根据QB/T 1803—1993《工业酶制剂通用试验方法》，以1,mL 酶液在37,℃、pH 8.0 条件下，每分钟反应产生1,μg 酪氨酸所需要的酶量为1 个酶活力单位(U/mL).

粗酶液用缓冲溶液稀释至适当浓度，作为待测酶液.缓冲液配制1%的酪素溶液作为底物并将粗酶液稀释适当的倍数.取1,mL 稀释的酶液，37,℃保温2,min，加入同样温度的底物 1,mL，于 37,℃反应10,min，加入2,mL 质量分数10%三氯乙酸终止反应.静置离心，取1,mL 上清液，加入5,mL 0.4,mol/L Na2,CO3溶液、1,mL 福林酚试剂，混匀，40,℃保温20,min，测定吸光度A680.以灭活酶液为空白对照.

1.6 酶学性质分析

1.6.1 温度对蛋白酶酶活的影响

分别将1,mL 粗酶液与1,mL 水解酪蛋白溶液(1%，pH 8.0)混匀，分别在4～50,℃ 测定酶活力，以酶活力最高时为100%，计算其他条件下的相对酶活力.

1.6.2,pH 对蛋白酶酶活的影响

用不同pH 的乳酸钠缓冲液(pH 2.0、3.0、4.0、5.0)、磷酸盐缓冲液(pH 6.0、7.0、7.5、8.0)、硼砂缓冲液(pH 9.0、10.0)将待测酶液进行适当的稀释，在37,℃及相应pH 条件下测定酶活，酶活数值最大者计为100%，所对应的pH 即为待测酶最适反应pH，其他pH 下的酶活与最高酶活的比值即为其相对酶活.

1.6.3 蛋白酶的热稳定性检测

将粗酶液分别在10、37、45,℃保温30、60、90、120,min 后测定残余酶活，以未进行保温处理的酶活力值作为对照，设定其相对酶活力为100%，得出酶活力随保温时间变化的曲线.

1.6.4 不同金属离子及化学试剂对蛋白酶酶活的影响

将待测酶液置于不同浓度(5、1,mmol/L)的Ca2+、Mg2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+、Mn2+、Ba2+缓冲液中，4,℃保温1,h，在pH 10.0、37,℃条件下测定残留的酶活.将待测酶液置于EDTA、PMSF、β-ME 缓冲液中，4,℃保温1,h，在pH 10.0、37,℃条件下测定残留的酶活.

2 结果与分析

2.1 产低温蛋白酶菌株的筛选

低温培养条件下不同菌株的蛋白水解圈形成情况如图1 所示.在低温培养条件下(4～10,℃)，经透明圈筛选以及划线纯化后复筛，共获得3 株具有分泌表达蛋白酶能力的菌株，分别将其编号为11813、11815 以及11816.其中菌株11815 的蛋白酶分泌表达能力较强，在培养温度为10,℃的条件下，24,h 内，其蛋白水解圈直径与菌落直径的比值(dH/dc)最高可达2.77；而在相同条件下，菌株11813 及11816 的dH/dc则分别仅有1.78 和1.60.

图1 低温培养条件下不同菌株的蛋白水解圈形成情况Fig.1 Cold protease transparent zone formed by strains

在不同培养温度下，分别对上述3 株产蛋白酶菌株进行液体发酵培养，菌株11815 在4～37,℃均可生长，其最适生长温度为20,℃左右，当温度大于等于40,℃时，则生长极为缓慢甚至停止生长；菌株11813及11816 的最适生长温度与菌株11815 相似，因此均属于典型的耐冷菌.由于菌株11815 的产蛋白酶能力较强，因此作为下一步重点研究对象.

2.2 菌株11815的分析鉴定

菌株11815 属革兰氏阳性菌，呈球形或卵圆形，直径约1.0～1.2,μm，呈双球状或连珠状排列；菌落形态圆形，颜色橙黄色，表面光滑、边缘齐整.该菌属好氧性或兼性厌氧菌，可较好利用葡萄糖、果糖、淀粉等碳源，能够利用硫酸铵、蛋白胨、水解酪蛋白等氮源；具有氧化酶、过氧化氢酶活性，明胶液化实验呈阳性.

该菌16S rDNA 全长序列为1,450,bp，与动性球菌(Planococcus antarcticus) DSM 14505 的相似度为99%，结合形态特征和生理生化特性，将其鉴定为动性球菌属.

2.3 温度和pH对菌株11815产酶的影响

在摇瓶发酵条件下，研究不同培养温度(15、20、25,℃)对菌株11815 产酶的影响，结果如图2 所示.结果表明：该菌株的最佳生长温度与最适产酶温度相一致，均为20,℃，发酵培养48,h 可达到产酶高峰，产酶量约为280,U/mL.在菌体培养的初级阶段，菌体的生长量与产酶量呈正比；当菌体生长达到平衡期后，菌体量不再增加，而粗酶液中的蛋白酶活性则开始下降，这可能与蛋白酶的自身降解有关.从上述实验结果推断：该蛋白酶的表达应为组成型表达，只与菌体量有关，而与其他诱导因素无关.因此在发酵过程中设法提高菌体浓度，同时在发酵液中加入适量蛋白酶抑制剂，可有效提高蛋白酶产量.

图2 培养温度对产酶的影响Fig.2 Effect of culture temperature on enzyme production

pH 对菌株产酶的影响较小，初始pH 在6～8 之间，菌株11815 均可稳定生长并产酶.

2.4 酶学性质分析

2.4.1 酶的最适作用温度及热稳定性检测

在不同温度下分别对菌株11815 发酵液中的蛋白酶活性进行了检测，结果如图3 所示.该菌株所产蛋白酶的最适作用温度为37,℃左右，并且在25～30,℃均有较好的催化活性(最高催化酶活的50%以上)，与其他低温蛋白比较发现，蛋白酶SKPB5 以及焦曲霉(Aspergillus ustus)、假单胞菌(Pseudomonas)strain DY-A 分泌的蛋白酶等，最适温度在 40～42,℃[8–10]，11815 分泌的蛋白酶的最适作用温度更低.因此，该菌株所产蛋白酶的最适作用温度与自然环境中的温度基本一致，在使用过程中可以省去加热及冷却的过程，具有节能环保等应用属性.

图3 蛋白酶的作用温度与相对酶活的关系Fig.3 The relationship between protease temperature and the relative enzyme activity

酶的热稳定性实验结果如图4 所示.该菌株所产蛋白酶的热稳定性较低，37,℃保温 20,min 或45,℃保温60,min 后，酶活仅剩原来的10%；50,℃保温10,min 后，则催化活性完全丧失；该蛋白酶只有在10,℃以下才能保存较长的时间；这一特性与大多数低温蛋白酶[7–9]相似，主要与低温蛋白酶本身较为松散的蛋白结构及其较高的分子柔性有关.

图4 蛋白酶的热稳定性Fig.4 Effects of temperature on the stability of protease activity

2.4.2 酶的最适作用pH

分别在不同pH 条件下测定菌株11815 所产蛋白酶活力，酶活力随pH 变化的曲线如图5 所示.该酶在pH 4.0～10.0 均具有催化活力，其最适作用pH为8.0 左右；当pH 升至9.0 时，其酶活约为最高酶活的70%左右，当pH 升至10.0 时，酶活大幅下降，仅为最高酶活的25%；当pH 降至7.0 时，酶活力约为最高活力的82%.因此，该菌株所产蛋白酶为低温蛋白酶.

图5 蛋白酶的作用pH与相对酶活的关系Fig.5 The relationship between pH of protease and the relative enzyme activity

2.4.3 不同金属离子及化学试剂对蛋白酶酶活的影响

不同金属离子及化学试剂对蛋白酶酶活的影响见表1.

表1 不同的金属离子、抑制剂对蛋白酶酶活的影响Tab.1 Effect of various metal ions and inhibitors on protease activity

金属离子Ca2+对该菌株所产蛋白酶有激活作用，Mn2+对其基本没有影响；Mg2+、Ba2+、Fe3+、Zn2+、Co2+、Ni2+则对其有一定的抑制作用，Ni2+对其抑制作用最强，浓度为1.0,mmol/L 的Ni2+可抑制90%以上的酶活，因此组氨酸可能是该酶的活性中心之一；EDTA 对该酶有一定抑制作用，某些金属离子可能对维持酶分子的三维结构有重要作用；另外，该酶被PMSF 强烈抑制，因此该菌株所产蛋白酶的活性位点应包括His、Ser 以及羧基氨基酸.

3 结语

从南印度洋深海沉积物中分离得到1 株产低温蛋白酶菌株，经菌种鉴定为动性球菌(Planococcus sp.).该菌株的最适生长温度为 20,℃左右，可在10～25,℃进行快速生长代谢；并在20,℃以下具有表达分泌低温蛋白酶的能力，最适的培养温度为20,℃，摇瓶发酵条件下，48,h 内的蛋白酶产量可达280,U/mL.酶学性质分析结果显示：该菌株所产蛋白酶的最适作用pH 为8.0，最适作用温度为37,℃，当催化温度降至30,℃时，酶活可保持在80%以上，并且在4,℃条件下仍具有水解蛋白的能力.EDTA 对该酶有一定抑制作用，PMSF 对该酶具有强烈抑制作用，因此该菌株所产蛋白酶的活性位点应包括His、Ser 以及羧基氨基酸.该酶热稳定性较差，50,℃仅保温1.0,min，则酶活完全丧失.由该菌株所产蛋白酶的上述特性表明，该酶属于典型的低温蛋白酶，具有一定的研究及开发价值.本课题组还将对该低温蛋白酶的编码基因进行分离与克隆，并进一步尝试在其他宿主菌中实现其高效异源表达.

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