瑞替普酶与阿昔单抗联合治疗对急性心肌梗死患者血小板活化的影响

汤祥瑞 ，孙超峰(西安交通大学第一附属医院心内科，陕西 西安 710061)

冠状动脉斑块破裂与血栓形成是导致血管阻塞和继发性心肌梗死的关键原因。研究表明，接受或不接受溶栓剂治疗的急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)患者，会出现血小板活化和止血、纤溶系统变化［1-3］。因此，血小板不仅同中性粒细胞发生相互作用，继而通过释放可溶性调控因子和(或)黏附分子及以中性粒细胞表达的反受体，来影响止血/血栓形成和炎症，而且还影响受刺激内皮细胞和单核细胞。同链激酶相比，尽管人们研究出更多纤维蛋白特异性试剂，但AMI 患者的溶栓治疗仍受促凝效果阻碍，可导致早期再闭塞。本研究探讨了AMI 患者接受溶栓疗法联合半剂量瑞替普酶(r-PA)和阿昔单抗对以血小板、中性粒细胞、单核细胞及可溶性血小板选择细胞作为相互作用和活化标记的膜黏附分子(CD41、CD42b、CD40 和CD40L)的影响。

1 资料与方法

1.1 资料来源

选取2014 年在西安交通大学第一附属医院心内科治疗的38 例AMI 患者，纳入标准为至少30 min 胸部不适症状持续，但不足6 h。排除标准:年龄＜18 岁;收缩压＞180 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，或舒张压＞110 mmHg;中枢神经系统结构异常;此前6 周有大手术或创伤;过去7 d 使用过糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa 抑制剂。经我院医学伦理委员会批准，患者或家属签署知情同意书。以随机数字表法将患者分为分为全量r-PA 治疗组(r-PA 单药组，n=18)与半量r-PA +阿昔单抗治疗组(联合治疗组，n=20)，另选择28 名健康人［19 名男性和9 名女性，平均年龄(48.7 ±1.9)岁］作为对照组。3 组患者一般资料的差异无统计学意义(P ＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法

r-PA 单药组患者给予注射标准剂量r-PA(爱德药业(北京)有限公司，批准文号:国药准字205009S30)10 U、1 日2 次，每次间隔30 min。联合治疗组患者给予滴注标准阿昔单抗(豪夫迈-罗氏公司，批准文号:国药准字S20020057)0.25 mg/(kg·min)，最快10 μg/min，用量0.125 μg/kg，持续12 h;同时，注射半剂量r-PA 5 U，每次间隔30 min。所有患者入院时口服阿司匹林300 mg，随后每日口服100 mg。采用诺谟图调节肝素给药，获得50～70 s 活化部分凝血活酶时间(activeated partial thromboplastin time，APTT)。

1.3 观察指标

在溶栓治疗前、治疗90 min 和3、12、16、24、48 h 时，采用口径19 号蝴蝶针经无损肘静脉穿刺进行血样采集。根据各样本10 000 个细胞，获得荧光信号分布图。通过低角度前向和直角散射激光，区别不同的白细胞群体，得到荧光标记细胞百分比和平均荧光强度。将单克隆抗鼠免疫球蛋白G(IgG)1和IgG 2a 作为对照抗体，以确定非特异性荧光和假阳性结合。采用定量免疫测定技术，测定可溶性P(soluble P，sP)-选择蛋白。采用商用分析方法，进行白细胞计数(WBC)、血小板计数(PLT)检测并测定APTT。

1.4 统计学方法

采用统计软件JMP 进行数据分析，数据以均数±标准差(¯x±s)表示。将非正态分布数据进行对数尺度转换，得到正态分布。采用方差分析Tuckey-Kramer HSD 检验以及Bonferroni-Holmes校正进行多重比较AMI 患者和对照患者间的数据。采用多元方差分析对随访数据进行比较，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组人群sP-选择素、WBC、PLT、APTT 水平变化比较

3 组人群sP-选择素、WBC、PLT、APTT 水平变化比较见表1。治疗前，与对照组比较，r-PA 组与联合治疗组患者sP-选择素水平均有所增加，随后直至治疗48 h;联合治疗组患者sP-选择素水平明显减少，在治疗48 h 时该值显著较低。治疗前，与对照组比较，AMI 患者的WBC 明显较高;治疗48 h 内，r-PA 单药组患者WBC 显著升高，而联合治疗组并未显著升高。治疗前，3 组人群PLT 相近;联合治疗组在治疗3 h 后，PLT 显著降低，在治疗48 h 时该值显著较低。治疗前，3 组APTT 值相近;治疗48 h 后，联合治疗组APTT 值显著降低。与r-PA 单药组比较，联合治疗组患者血小板活化单元(platelet activation units，PAU)显著减少，在治疗48 h 时该值显著较低，见图1。

表1 3 组人群sP-选择素、WBC、PLT 和APTT 水平变化比较(¯x±s)Tab 1 Levels of soluble P-selectin，WBC，PLT and APTT in three groups(¯x±s)

图1 r-PA 治疗组、联合治疗组患者PAU 水平变化比较Fig 1 Levels of platelet activating factor in combined treatment group vs.r-PA group

2.2 3 组人群CD41、CD42b、CD40 与CD40L 水平变化比较

3 组人群CD41、CD42b、CD40 与CD40L 水平变化比较见表2。治疗前，AMI 患者CD41 阳性单核细胞和粒细胞的百分比高于对照组;治疗3h后，与治疗前、治疗90min比较，联合治疗组患者CD41 阳性单核细胞和粒细胞百分比显著减少(P＜0.01);治疗48 h 时，与r-PA 单药组比较，联合治疗组患者CD41 阳性单核细胞和粒细胞百分比显著较低(P＜0.05)，表明白细胞-血小板黏附较弱。治疗前、治疗3 h 后，联合治疗组患者CD42b 阳性单核细胞和粒细胞减少速度更快(P＜0.01);治疗48 h 时，联合治疗组患者CD42b 阳性粒细胞值显著低于r-PA 单药组(P＜0.05)。治疗前，AMI 患者CD40 阳性粒细胞百分比稍高;治疗48 h 时，联合治疗组患者CD40 阳性单核细胞和粒细胞百分比显著低于r-PA 单药组(P＜0.01)。此外，在治疗前、治疗3 h 间，联合治疗组患者单核细胞呈减少趋势(P=0.07)，其CD40 阳性粒细胞百分比呈显著减少趋势(P＜0.05)。治疗前，AMI 患者CD40L 阳性白细胞百分比及CD40L 对单核细胞和粒细胞的表达强度均高于对照组;治疗3 h 后，联合治疗组患者CD40L 阳性单核细胞百分比显著低于r-PA 单药组(P＜0.01)，CD40L 粒细胞百分比低于r-PA 单药组(P=0.06)。

3 讨论

炎症介质、凝血酶或缺氧刺激后几分钟内，可在内皮细胞表面表达。sP-选择素调节血小板同内皮/白细胞的黏附作用及对内血小板聚集和初始GPⅡb/Ⅲa 纤维蛋白原相互作用的稳定非常作用。SP-选择素来自细胞表面脱落或分裂片段。本研究中，治疗前AMI 患者sP-选择素值高于对照组;联合治疗组患者sP-选择素水平在治疗3 h 后减少并在治疗48 h 时显著较低，表明这一疗法对血小板活化有积极作用，可减少血小板诱导及白细胞调节对进一步心肌损伤不良影响的程度。

治疗后16 h，GPⅡb/Ⅲa 受体对血小板的推荐抑制程度≥80%(PAU ＜30～40)，达到阿昔单抗治疗效果。联合治疗组在治疗3 h 时血小板-单核细胞聚集显著减少。有文献报道，AMI患者中黏附分子Mac-1 表面表达对黏附血小板单核细胞有上调作用。活化血小板黏附到单核细胞，可诱导白细胞介素1β、白细胞介素8 和单核细胞趋化蛋白1 的表达，导致全身炎症反应综合征，常见于急性冠状动脉综合征。因此，r-PA/阿昔单抗联合疗法可能降低单核细胞活化，对单核细胞-内皮细胞黏附产生有利影响，并减少单核细胞同固定纤维蛋白原的黏附，减少组织因子表面表达和因活化单核细胞隐秘代谢物造成的其他急性全身炎症过程［4-5］。

粒细胞已被证明与再灌注损伤有关，粒细胞上的Mac-1 有助于同中心粒细胞集合体的黏附和在内皮上的迁移［6-7］。本研究中，2 组AMI 患者的血小板-粒细胞聚合体在治疗前增加，同r-PA 组比较，联合治疗组在治疗3 h 时有所减少，并在48 h时显著较低。血小板-粒细胞聚合体可通过白细胞上P-选择素糖蛋白配体1进行识别的活化血小板上的P-选择蛋白对血小板-白细胞相互作用进行调节，通过纤维蛋白原作为GP Ⅱb/Ⅲa 和Mac-1 的一般配合基，由阿昔单抗阻碍GPⅡb/Ⅲa 受体，减少血小板-粒细胞聚集体，对内皮、组织损伤和凝血的粒细胞调节效果有更有利的作用［8-9］。

表2 3 组人群CD41、CD42b、CD40、CD40L 阳性单核细胞和粒细胞百分比变化比较(%，¯x±s)Tab 2 Percentages of positive monocytes and granulocytes of CD41，CD42b，CD40 and CD40L in three grousp(%，¯x±s)

GPⅡb(CD42b)是GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ合成物的一部分，是数量居第2 位的血小板受体。除凝血酶结合GPⅠb，GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ调节血小板同血管壁血管性血友病因子(vWf)的黏附，可在损伤后快速定位到动脉内皮下膜［10］。通过纤维蛋白原和vWf 的细胞间连接同活化GPⅡb/Ⅲa 血小板的聚集，导致血栓进一步扩张。本研究中，2 组AMI 患者对血小板-粒细胞和血小板-单核细胞聚集的CD42b 表达强度在治疗前较低，与文献报道一致［11］。治疗3 h 后，联合治疗组患者血小板-单核细胞和血小板-粒细胞聚集明显下降，r-PA 组患者在治疗48 h 时对单核细胞和粒细胞的CD42b 表达强度低于联合治疗组。

CD40-CD40L 受体-配对在抗原呈递和T 细胞/巨噬细胞活化中扮演重要作用，调节动脉粥样硬化中的细胞相互作用。活化瞬间和血栓形成过程中，CD40L 在血小板表面进行表达。CD40 体外连接导致巨噬细胞的抗凝组织因子诱导，以及诱导E-选择蛋白和血管细胞黏附分子1(VCAM-1)的表达。CD40连接也刺激金属蛋白酶(涉及斑块重塑)，有助于斑块/细胞外基质分解。CD40L 在巨噬细胞提供协同刺激信号，产生促炎细胞因子(肿瘤坏死因子α、白细胞介素6 和白细胞介素8)。血小板CD40L 可激活人体脐静脉内皮细胞的黏附蛋白的表达，诱导其表达MCP-1 和白细胞介素8。联合治疗组患者治疗3 h后，CD40 阳性粒细胞、CD40 和CD40L 阳性单核细胞百分比、单核细胞的CD40 表达强度显著减少。联合疗法使血小板-单核细胞和血小板-粒细胞聚合体显著减少，因此，联合疗法可能有助于减少单核细胞和中性粒细胞活化状态，从而对粒细胞-内皮细胞黏附产生有利影响。

综上所诉，半剂量r-PA 与阿昔单抗联合溶栓治疗，可诱导血小板-单核细胞显著降低，以及血小板-粒细胞聚合体部分降低，而r-PA 治疗的单核活化情况可能更少，对单核细胞-粒细胞黏附及对组织损伤的影响有利，可减少因活化单核细胞隐秘代谢物产生的其他急性局部炎性过程，减少血小板-粒细胞聚合体同内皮下膜的黏附。

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