Springbio抗体芯片技术研究鼻咽癌差异表达蛋白*

周小军汪芸林葆睿

Springbio抗体芯片技术研究鼻咽癌差异表达蛋白*

周小军1汪芸2林葆睿1

目的探讨鼻咽癌病灶组织的差异表达蛋白特征。方法初诊鼻咽癌及慢性鼻咽炎患者各4例，应用可同时分析722个蛋白的Springbio抗体芯片检测不同性质鼻咽组织标本蛋白质谱表达差异，探讨鼻咽癌组织的差异蛋白表达模式。结果相比于慢性鼻咽炎组织，鼻咽癌组织表达活性明显上调的蛋白有13个，主要包括生长因子类蛋白、癌基因及抑癌基因类蛋白、癌扩散与转移类蛋白、体液免疫类蛋白和治疗相关性蛋白；表达显著下调的有9个蛋白，主要包括细胞免疫类蛋白、营养类蛋白、角蛋白、集落刺激因子和其它蛋白。结论未治鼻咽癌原发灶组织中存在着明显的差异表达蛋白质谱特征。

鼻咽癌；蛋白质表达谱；差异表达特征；抗体芯片技术

癌症研究已成为医学研究的热点，专家们已从不同角度不同层次筛选了可能致癌的基因及蛋白，但癌症的发生及发展涉及到多种因素及层面，筛选出的鼻咽癌差异表达蛋白是否在不同的癌症中都发生作用以及它们的在具体癌症中的群体表达情况，均有待于确认。鼻咽癌为好发于中国南方的恶性肿瘤，具有明显的地域性，号称广东瘤。故本项目拟在鼻咽癌高发区广东中山市选择高通量的Springbio抗体芯片技术研究鼻咽癌群体蛋白的表达，结果报道如下。

材料与方法

1 材料

鼻咽组织标本，来源于广州中医药大学附属中山医院门诊病例，初诊未治鼻咽癌4例：女3例，男1例，平均35岁，均为分化型非角化型癌。临床分期按2008年全国鼻咽癌分期标准，均为T1N1M0（2期）患者，无全身转移。鼻咽炎4例：均为男性，平均33岁。中医体质分型参照既往研究[1]：4例鼻咽癌病人，气虚质及正常质各2例；4例鼻咽炎病人，气虚质及正常质各2例。检测物为新鲜的鼻咽组织，-80℃保存。

Springbio高通量抗体芯片（美国），具有高特异性及高纯度，每一种抗体纯度均为WB、IP和IHC级别，芯片内探针为两次重复，可使结果更为准确。芯片可同时检测722个目标蛋白，涉及多种重要生物学功能，包括：①Cancer Markers，②Cell Cycle, Stress Response and DNA Damage Repair，③Apoptosis，④Tumor Metastasis，⑤Oncogene，⑥Tumor suppressors，⑦Cell Differentiation，⑧Tumor Signal Transduction，⑨Others，如：6-Histidine,Beta-Galactosidase,Biotin,Bromodeoxyuridine，Bromodeoxyuridine,Fluorescein Isothiocyanate,GFP,GST,HA,Luciferase,Maltose Binding Protein。

2 方法

2.1 样品蛋白质抽提

取适量（250～500mg）鼻咽组织样品于冰上，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂，每1ml蛋白抽提试剂中加入5ul蛋白酶抑制剂，5ulPMSF和5ul磷酸酶混合液，匀浆后，4℃12000g离心15mins，取上清。

2.2 蛋白质定量

按KCTM BCA蛋白质定量试剂盒（KangChen KC-430）操作说明操作，测定样品蛋白浓度。以校正的BSA标准蛋白在570nm测量值对其浓度（μg/ml）做图绘制标准曲线，每个样本的蛋白含量见表1。

表1 Protein Quantification by BCA Protein Assay Kit

2.3 蛋白标记

取等量蛋白样品加1ul Cy3标记的Dylight 550 NHS（Pierce,Cat.#66262,USA） 和 5ul labeling Buffer，室温标记1h，每10mins震荡一次。将spin-OUT GT-600 Micro columns（G Biosciences,Cat.# 786-170,USA）用1xTBS洗涤3次，200ul/次，室温2000g离心5mins，弃流出液。把标记的蛋白样品加入spin-OUT GT-600 Micro columns中室温2000g离心5mins，以去除未标记的荧光染料。

2.4 荧光标记的蛋白样品与芯片杂交

标记的样品加等量的5%BSA与芯片进行杂交，室温2h并避光。

2.5 图象扫描，分析

使用Genepix 4000B（Axon,USA）进行图像扫描，使用532nm激光激发，测定实验样品各点的信号强度。图像存成TIF文件，利用软件Genepix Pro 6.0（Axon,USA）分析数据，实验数据出现“N/A”则不纳入数据统计，统计分析考虑到中医体质可能对蛋白表达的影响，故以中医体质作为协变量进行协方差分析。

结果

1 鼻咽癌及鼻咽炎蛋白芯片检测结果，见图1。

2 鼻咽癌患者表达上调的差异蛋白

在鼻咽癌与鼻咽炎芯片结果对比分析中，剔除检查结果显示为“N/A”者(即检验结果不稳定不可靠者)，选择在所有8个标本中均有稳定表达者进行分析，发现鼻咽癌表达上调的蛋白有13个，见表2。包括①生长因子类蛋白如Hepatocyte Growth Factor，上调3.7倍，GnRH Receptor，上调1.78倍，thymidine phosphorylase，上调1.66倍，growth factor receptor—bound 2，上调1.43倍。②癌基因及抑癌基因类蛋白，如RPA/p70，上调3.87倍，Retinoblastoma上调2.21倍，von Hippel-Lindau Protein，上调1.89倍，CDK1上调1.48倍。③癌扩散与转移类蛋白，如CD42b上调2.89倍，CAl9-9上调1.91倍，CDl06上调 1.80倍。④体液免疫类蛋白如 Plasma Cell Marker上调2.23倍。⑤与鼻咽癌治疗相关的蛋白如P170上调2.41倍。

图1 鼻咽癌及鼻咽炎Springbio蛋白芯片图

表2 鼻咽癌表达上调的13个蛋白(n=4)

3 鼻咽癌患者表达下调的差异蛋白

鼻咽癌表达下调的蛋白有9个，见表3，包括①某些抑癌基因蛋白，如SHP-1下调2倍。②细胞免疫类蛋白如MHC II(HLA-DQ)下调1.8倍。③营养类蛋白如Milk Fat Globule Membrane Protein下调1.79倍。④角蛋白如Keratin 8下调了2.22倍。⑤集落刺激因子如CD115/c-fms/CSF-1R/M-CSFR下调了1.7倍。⑥其它蛋白，如GAD65下调2.86倍，CD1下调2.38倍，ribonucleoprotein下调2.02倍，14.3.3 gamma下调1.43倍。

表3 鼻咽癌表达下调的9个蛋白(n=4)

讨论

癌症的发生发展是一个错综复杂的过程，在此漫长过程中，抑癌基因的失活、癌基因的激活、细胞分化及凋亡、细胞周期的启动及限制、DNA损伤与修复等，以及它们之间不同层次复杂的网络式调节，最终导致了癌症的发生、扩散和转移。单一基因或单个蛋白的研究奠定了癌症研究的基础，再利用抗体芯片技术，将蛋白质分子作为配基，将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列，用标记了荧光的蛋白质进行抗原抗体反应，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白差异，研究在其它癌症有致癌作用的蛋白是否在鼻咽癌也有致癌作用及其群体在鼻咽癌的表达情况，研究显示，鼻咽癌既有表达上调的蛋白亦有表达下调的蛋白，有统计差异的上调蛋白有13个，下调蛋白有9个，上调蛋白主要包括①生长因子类蛋白，如Hepatocyte Growth Factor，GnRH Receptor，thymidine phosphorylase，growth factor receptor—bound 2。②癌基因及抑癌基因类蛋白，如 RPA/p70，Retinoblastoma，von Hippel-Lindau Protein，CDK1。③癌扩散与转移类蛋白，如CD42b，CAl9-9，CDl06。④体液免疫类蛋白如Plasma Cell Marker。⑤与鼻咽癌治疗相关的蛋白如多药耐药蛋白P170等。下调蛋白主要包括①抑癌基因类蛋白如SHP-1。②细胞免疫类蛋白如MHC II(HLA-DQ)。③营养类蛋白如Milk Fat Globule Membrane Protein。④角蛋白如Keratin 8。⑤集落刺激因子如CD115。⑥其它蛋白，如GAD65、CD1、ribonucleoprotein、14.3.3 gamma等。

1 上调蛋白分析

1.1 生长因子类

肿瘤病的实质就是瘤细胞的失控性生长，而失控性生长与各种各样的生长因子关系非常密切。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)属于纤溶酶原依赖性的生长因子家族，是一种间质来源的多效性生长因子，具有促细胞分裂、增生、迁移、分化以及促进血管内皮细胞增生和新生血管形成等广泛的生物学活性，在肿瘤形成过程等方面亦发挥重要作用。既往研究报道，HGF在鼻咽癌表达要高于鼻咽炎组织，且利于肿瘤血管生成和转移[2]。促性腺激素释放激素GnRH及其受体在许多生殖性肿瘤及非殖性肿瘤细胞中有着很高的表达，卵巢、子宫内膜、前列腺、垂体、胰腺和肝脏发生的肿瘤细胞上有GnRH结合位点，GnRH类似物可抑制这些肿瘤细胞生长。体内、外实验均表明，GnRH受体水平的不同和信号途径的活化影响了卵巢癌细胞的凋亡，从而导致GnRH对细胞增殖的特异性影响[3]。胸苷酸磷酸化酶(thymidine phosphorylase，TP)亦称血小板源性内皮细胞生长因子，是由多种细胞产生的内源性肽类生长因子，具有内皮细胞丝裂原样作用，可促进血管新生，主要功能是参与肿瘤的新生血管形成和肿瘤转移。正常组织内TP表达受到严格调控，表达水平很低，甚至检测不到，而在某些肿瘤如胃癌、大肠癌、乳腺癌、宫颈癌和肺癌组织中过度表达,并对胃癌、大肠癌、乳腺癌和宫颈癌的血管生成有明显促进作用[4]。生长因子受体结合蛋白2(growth factor receptor—bound 2，GRB2)是位于细胞膜上的一种衔接蛋白，在肿瘤发生、转化、侵袭及转移过程中起重要作用。直接参与多种恶性肿瘤的发病、进展及转移[5]。

1.2 癌基因及抑癌基因类蛋白

它们与肿瘤的发生息息相关。细胞周期蛋白依赖激酶是调控细胞周期的一个蛋白家族，其成员有CDK1～CDK9，CDK1可以促进G2/M期转换而加速细胞周期进程而与癌的发生发展相关。细胞实验显示[6]鼻咽癌CNE2细胞CDK1和survivin表达上调。抑癌基因为抑制癌发生的基因，其表达的蛋白应是抑制癌症的发生，故在癌症中其活性功能应性下降的，但我们对鼻咽癌的研究发现，抑癌基因对应的某些蛋白却是上调表达的，如VHL蛋白、视网膜母细胞瘤蛋白和复制蛋白A。VHL是一种肿瘤抑制基因，具有调节转录、稳定细胞生长和调节细胞周期的功能。也有学者研究发现[7]，视网膜母细胞瘤蛋白在鼻咽癌为高表达，在正常鼻咽组织中低表达，其癌变机理为通过p16-CyclinDl／CDK4-pRb信号通路参与调控鼻咽癌细胞周期，进而影响鼻咽癌的发生。复制蛋白A是真核细胞单链DNA结合蛋白，在DNA复制、修复及损伤应激反应过程中均起着重要的作用，是DNA稳定蛋白，起抑制癌症的发生的作用，但我们研究表明，在鼻咽癌组织中存在着高表达，这与国外在研究食管癌时也发现其存在高表达相类似[8]。其可能的原因为，因肿瘤细胞在癌变时出现了大量的单核苷酸突变，存在着大量的DNA异常，激起RPA的增高以满足DNA修复增加的需要，即肿瘤中可能存在DNA修复需要增强的反馈调节机制。

1.3 与癌转移有关的蛋白

CAl9-9即Lewis血型抗原，是一种糖蛋白，存在于唾液与血浆中的可溶性抗原。它在肿瘤转移过程中起着重要作用，是某些肿瘤细胞的特异性的终表达产物，可被某些恶性细胞表达并分泌于体液中，常在胃癌、结肠癌等消化道肿瘤中出现高水平表达。CDl06（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1，血管内皮细胞粘附分子-1)为免疫球蛋白超家族成员，主要存在于血管内皮细胞膜上，可调节细胞与细胞，细胞与细胞外基质间相互粘合，可参与细胞迁徙、锚定、增殖分化和细胞内信号转导的调控，在白血病、淋巴瘤等恶性血液病患者粘附分子表达增高，我们在鼻咽癌实体瘤中也发现CDl06的增高，与既往研究报道结果相类似[9]。CD42b是血小板膜表面的主要糖蛋白之一，正常情况下均匀分布在整个血小板膜的表面，若CD42b表达的减少可促进血小板的聚集与释放反应。冠心病患者CD42b的阳性表达显著低于正常对照，血小板与肿瘤细胞通过各自膜表面表达的精蛋白受体及其配基的连接作用相互激活以影响肿瘤细胞的转移过程。在鼻咽癌组织中CD42b的增高，可以加速鼻咽癌细胞的迁移。

1.4 与癌治疗有关的蛋白

P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gP或P170)亦称多药耐药蛋白，介导的多药耐药是最早研究并得到临床证实的耐药机制，P170蛋白在肿瘤组织表达高于正常组织。Chen(10)等研究发现，P170在原发性鼻咽癌中占12.6%，复发性鼻咽癌中占32.6%，认为P170介导的MDR机制在原发性鼻咽癌MDR中不占主导地位，但在复发性鼻咽癌中有表达较高。

2 下调的蛋白分析

2.1 细胞免疫

表现为MHC II分子（即主要组织相容性复合体II类分子）表达低下。MHC II分子的主要功效是在免疫应答的始动阶段将经过处理的抗原片段递呈给CD4T细胞的抗原受体，导致辅助性T细胞激活和分化从而诱发免疫应答。正常情况下，此蛋白的表达受到机体严密调控,若缺乏MHC II类分子（比如肿瘤）可致免疫原性降低，从而致抗肿瘤免疫功能下降，肿瘤细胞膜表面MHC分子表达的降低或缺失是逃逸机体免疫监视的重要原因之一，增强肿瘤细胞中MHC分子的表达是激活肿瘤抗原特异性T细胞进行肿瘤免疫治疗的关键[11]。相反，与体液免疫有关的蛋白如Plasma Cell Marker(浆细胞具有合成、贮存抗体即免疫球蛋白的功能，参与体液免疫反应)，在鼻咽癌却是表达上调的。

2.2 营养性蛋白

目前研究表明乳脂球膜蛋白与免疫、吞噬、信号传导及细胞周期有关[12]，而且能抑制癌细胞的生长[13]。本研究发现，乳脂球膜蛋白表达低下可能与鼻咽癌发生发展有关。

2.3 抑癌基因

造血细胞酪氨酸磷酸酶SHP-1已被认为是在淋巴瘤、白血病和其他肿瘤中的抑癌成份[14,15],SHP-1基因甲基化导致SHP-1蛋白表达的减少和缺失被认为是淋巴瘤、白血病细胞株和其他肿瘤细胞的典型特征。本研究中也发现SHP-1在鼻咽癌中为低表达。

2.4 角蛋白

角蛋白(CK)是表皮细胞的结构蛋白，它们构成直径为10 nm的微丝，在细胞内形成广泛的网状结构，在人体的上皮组织中有不少于20种不同种类的CK表达，CK具有维持细胞力学完整性及细胞调节作用，其结构及功能缺陷会导致多种疾病或各种恶性肿瘤。CK在鼻咽癌的表达，在不同的研究中有不一致的表现中南大学发现，CK13在鼻咽癌为低表达[16]，且低表达与过甲基化有关[17]；Bommol等[18]发现CK13基因的改变与宫颈癌患者有无淋巴结转移以及宫颈癌患者的复发无关，而与宫颈癌的预后有关，即CK13基因表达高的预后好，CK13基因表达低者预后差。而另一些研究[19]发现，CK19在鼻咽癌为高表达。CK8与CK18在其它肿瘤多表现为高表达，角蛋白在不同肿瘤这种不一致的表达情况，可能与不同组织的组织特异性有关，有待于进一步研究。

2.5 集落刺激因子

集落刺激因子(CSF)的主要功能是刺激骨髓未成熟细胞分化成熟，是血细胞发生必不可少的刺激因子，既往的实验及临床研究证实其在许多恶性肿瘤CSF都有异常升高的表现，如淋巴瘤、肝癌等。但本研究发现其在鼻咽癌为低表达，可能与肿瘤异质性有关；另一个有趣情况是，虽说CSF在多数肿瘤为高表达，但现今肿瘤临床上已常规应用重组人CSF预防或治疗化疗引起的粒细胞减少症[20]，这矛盾的做法是否可以认为CSF高表达会有益于这些肿瘤，值得深和探讨。

3 反常情况

3.1 GAD65

为γ-氨基丁酸(GABA)合成的关键酶，而GABA源性系统在调节细胞生长发育等方面起重要作用，近年研究发现恶性肿瘤[21](如胰腺癌等)GAD65表达水平明显高于其正常组织和良性病变，认为GAD65表达与恶性肿瘤发生、生物学行为等有密切关系。但本研究中，GAD65在鼻咽癌中为低表达。

3.2 细胞周期素D1(CyclinDl，CDl)

在多种恶性肿瘤中的均已发现CD1的过度表达，如乳腺癌、胰腺癌、肝癌、食管癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、大肠癌等。现已将CD1看作癌基因。在多种肿瘤中均有CD1基因扩增和／或表达增强。但本研究中，CD1在鼻咽癌中为低表达。

运用高通量、高特异性的抗体芯片技术研究得出的结论。有待于今后临床的进一步研究证实。

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（收稿:2014-10-09 修回：2014-10-28）

Differentially expressed protein determination in nasopharyngeal carcinoma tissue by Springbio antibody chip technology

ZHOU Xiaojun,WANG Yun,LIN Baorui
Department of otorhinolaryngology,zhongshan hospital affiliated to Guangzhou university of TCM. Guangdong,528401,China

ObjectiveTo investigate the characteristics of differentially expressed proteins in nasopharyngeal carcinoma(NPC) tissue determined by Springbio antibody chip techniques.MethodsIncluded in this study were 4 untreated NPC patients and 4 cases of chronic nasopharyngitis,with total proteins extracted from their biopsied nasopharyngeal tissue samples and assayed by Springbio antibody protein chip,which could detect 722 protein dots simultaneously,to determine the characteristics of differentially expresed proteins in these tissue samples with different lesion quality,especially their expressive model in NPC tissue.ResultsAs compared with that in the tissue samples with nasopharyngitis,NPC tissue samples were determined with 13 proteins up-regulated in their expressive activities,mainly being those of growth factor proteins,oncogene and tumor suppressor proteins,carcinoma proliferation and metastasis related proteins,humoral immune proteins,and anti-tumor activity associated proteins,and 9 proteins down-regulated in their expressive activities,mainly being cellular immune proteins,nutritional proteins,keratin proteins,colony stimulating factor proteins,and some other kinds of protein.ConclusionsAs shown from this study,there is a significantly characteristic profiling model in the differentially expressed proteins in untreated primary focus tissue of nasopharyngeal carcinoma.

Nasopharyngeal carcinoma;Protein expressive profile;Differentially expressed characteristics;Antibody chip techniques

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2015.04.003

*国家自然科学基金（NO:81072847，NO:81373698）

1 广州中医药大学附属中山医院耳鼻咽喉科(中山市，528401）

2 广州中医药大学附属中山医院病理科

周小军，主任医师.Email:zd1232@126.com