棘霉素对伊马替尼敏感及耐药K562细胞ERK、AKT和SPK表达的影响

许严伟,林海红,杜钢军*

(1.洛阳市第三人民医院药剂科,河南洛阳471002;2.河南大学药学院,河南开封475004)

棘霉素对伊马替尼敏感及耐药K562细胞ERK、AKT和SPK表达的影响

许严伟1,林海红2,杜钢军2*

(1.洛阳市第三人民医院药剂科,河南洛阳471002;2.河南大学药学院,河南开封475004)

目的比较棘霉素对伊马替尼敏感及耐药K562细胞ERK、AKT和SPK表达的影响。方法MTT法检测细胞存活率,Western blot检测ERK和AKT的表达,同位素掺入检测SPK的活性。结果棘霉素对K562和耐伊马替尼细胞的IC50分别为0.82 mg/L和0.87 mg/L;棘霉素对ERK和AKT均有不同程度的抑制作用;耐药K562细胞中SPK的表达远高于敏感细胞,且棘霉素对耐药细胞中的SPK活性有显著抑制作用。结论棘霉素对敏感及耐药K562细胞均有较强的抑制作用,其机制与抑制ERK、AKT和SPK的作用有关。

棘霉素;K562;耐药;ERK;AKT;SPK

甲磺酸―伊马替尼(格列卫)是基于对癌细胞分子作用机理的了解而合理设计开发的第一个抗癌新药,被誉为里程碑式的发现。作为首个上市的分子靶向治疗药物,开创了肿瘤分子靶向治疗的新时代。伊马替尼在挽救了无数慢性粒细胞白血病(CML)患者的同时,也赢得了无数的荣誉[1]。伊马替尼自1999年开始进入临床试验,对干扰素无效的慢性期CML患者,血液学完全缓解率可达100%,细胞遗传学缓解率为53%,13%患者获得完全细胞遗传学缓解。然而,现在临床发现,应用伊马替尼虽然能够使急变期的CML完全缓解,但大部分患者对伊马替尼的应答期较短,肿瘤细胞最终对其耐药而使CML复发[]。

因此,开发与伊马替尼作用机理不同,能克服肿瘤细胞对伊马替尼耐药性的新型药物成为当前CML治疗的迫切需要。我们实验室通过对我国边远地区土壤微生物的筛选,发现一株土壤放线菌提取物,经过活性追踪分离纯化并鉴定其中的活性成分是蒽醌类抗生素―棘霉素(echinomycin)。K562细胞系来源于急变期CML患者,是研究CML经典的细胞模型。我们选择正常K562细胞及对伊马替尼耐药的K562细胞(K562/Ima)为靶细胞,初步观察了棘霉素这两种细胞中细胞外信号调节激酶(ERK)、蛋白激酶B通路(AKT)和鞘氨醇激酶(SPK)的表达,为临床克服伊马替尼耐药,寻找新的药物提供佐证。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞株:K562细胞由军事医学科学院生物工程研究所惠赠;K562耐伊马替尼细胞K562/Ima由中国医学科学院天津血液研究所惠赠。K562和K562/ Ima细胞均于含体积分数10%胎牛血清和青霉素、链霉素各10×105U/L的RPMI 1640,37℃、体积分数5%CO2恒温培养箱中培养,实验时选用对数生长期的细胞。

试剂与药品:磷酸化和非磷酸化ERK1/2和AKT的抗体为Sant Cruz公司产品;(γ-32P)ATP购自北京福瑞生物工程公司;鞘氨醇、MTT、ATP购自Sigma公司;其他试剂皆为国产分析纯试剂。

仪器:BIO-RAD垂直电泳仪,选自美国Bio-Rad公司。

1.2 MTT检测

选择对数生长期的细胞,用含体积分数10%胎牛血清培养基将细胞配成细胞浓度为(4～5)× 105个/m L的细胞悬液,接种于96孔细胞培养板中180μL/孔,于体积分数5%CO2培养箱内37℃继续培养24 h后。实验组加入不同浓度的棘霉素各20μL,使其终浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、3.0μg/L。另外,设对照组加入不同浓度的伊马替尼, K562组其终浓度分别0.03、0.01、0.1、0.3、1.0、3.0 mg/L。K562/Ima组分别为0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、20.0 mg/L。各对照组加入20μL培养基,另设空白组,每组4个复孔。再培养48 h后,平板离心后除去上面培养基每孔加MTT质量分数0.5 g/L的PBS(p H6.8)溶液100μL,继续培养4 h;每孔加DMSO 100μL,避光振荡5 min,充分溶解后,于酶标仪570 nm处检测吸光度值(OD值)。以加药孔OD值与对照孔OD值的百分比为细胞存活率,根据细胞存活率和药物浓度的对应关系用SPSS软件求药物的IC50。

细胞的耐药倍数计算方法:

耐药倍数(RF)=耐药细胞(IC50)/敏感细胞(IC50)

1.3 ERK、AKT蛋白检测

K562和K562/Ima 2种细胞,设空白对照组和高、中、低剂量组共8组。高、中、低的棘霉素终浓度分别为1.0、2.0、4.0μg/L。作用细胞12 h后,收集细胞于离心管中。细胞裂解(注:冰上操作)细胞经预冷的PBS洗2遍,转入1.5 m L EP管中,离心后加入100μL细胞裂解液放置,4℃裂解40 min。4℃, 10 000 g,30 min离心浓缩,将上清液转移至另一微量离心管中,保存于―70℃待用。用BCA法测定蛋白含量,取蛋白样品等量,每个样品中加入上样缓冲液。将从K562和K562/Ima细胞中提取的10μg蛋白样品用质量分数10%聚丙烯酰胺凝胶进行分离,并转移到PVDF膜上,进行免疫印迹分析。过程如下:用脱脂牛奶对膜进行封闭,加入1∶1 000稀释的一抗,常温孵育2 h,用含体积分数0.1%Tween 20的TBS洗膜3次,加入1∶3 000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗,常温孵育45 min,用含体积分数0.1% Tween 20的TBS洗膜3次,加入发光剂,曝光显影。

1.4 SPK的活性检测

参照文献[3]进行,分别收集处于对数生长期、细胞浓度约为5×106U/m L的K562、K562/Ima细胞,离心,加入细胞裂解缓冲液,冻融裂解3次;4℃, 14 000 g离心20 min,收集上清液。蛋白定量后取45μL样品和Sphingosine(溶解于质量分数为5% Triton X-100)中混匀;在同位素室内加入2.5μL/管(32P)ATP(10μCi,20 mmol/L)含MgCl2(200 mmol/L),37℃反应5～15 min;加入1 mol/LHCl 5μL和氯仿0.2 m L氯仿∶甲醇∶盐酸(体积比100∶200∶1)剧烈振荡,终止反应;再加入氯仿60μL和2mol/L氯化钾60μL,12 000 g离心5 min;弃去水相,取15μL有机相样品点样于硅胶上,于层析液中展开40 min;放射自显影;扫描结果,用图像分析软件Scionimɑge分析光密度。

2 结果

2.1 对ERK1/2表达的影响

K562/Ima相对于K562的RF为24。棘霉素对K562细胞及K562/Ima细胞的IC50分别为0.82μg/L和0.87μg/L。对ERK1/2的表达,见图1。

图1 棘霉素影响K562、K562/Ima细胞中ERK1/2的表达

2.2 对AKT表达的影响(见图2)

图2 棘霉素影响K562、K562/Ima细胞中AKT的表达

2.3 细胞中SPK的活性(见图3)

γ-32P法检测K562/Ima和K562细胞中SPK活性结果,见图3。

图3 SPK活性的TLC结果

3 讨论

Boulton等[4]分离鉴定了一种蛋白激酶的cDNA序列,并证实多种细胞外信号均可激活该蛋白激酶。因此,将其命名为细胞外信号调节激酶1(ERK1),分子量为44KD。1991年,Boulton等[5]又鉴定了大鼠ERK亚家族的一个主要成员ERK2,分子量为42KD。ERK主要被各种生长因子、离子射线、过氧化氢等激活而磷酸化(p-ERK),进入细胞核作用于Elk21、c-myc、AP21等转录因子,促进某些基因的转录与表达[6]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)是信号从细胞表面传递到细胞核内部的重要介质,也是联系细胞膜受体与细胞内重要调节靶目标的进化保守的酶类。Steinmetz等[7]提出,MAPK磷酸酶(MKP-1)的表达提高与ERK1/2的灭活有关。通过对肿瘤细胞系的蛋白酶抑制剂的治疗增加了MKP-1合成,减少ERK1/2的磷酸化,从而抑制了肿瘤细胞的增殖。

PI-3K/Akt(磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路)作为细胞内重要信号转导途径之一,通过影响下游凋亡相关蛋白、细胞周期调节蛋白等效应分子的活性,在抑制细胞凋亡和促进增殖中发挥着极为重要的作用。它具有以下作用:①促进细胞的生长和增殖;②抑制细胞凋亡;③促进细胞侵袭和转移;④促进血管生成;⑤抵抗化疗和放疗中的细胞凋亡。AKT作为生长因子受体超家族信号转导过程中重要成员,可受多种细胞因子和理化因素激活,是联系细胞内外信号的关键分子[8]。

SPK-S1P信号通路是近年来被许多研究者所重视的一条有关细胞存亡、增殖的信号途径。SPK是一种高度保守的脂类激酶,可激活鞘氨醇(Sp)而生成磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate,S1P)。细胞内S1P的水平受SPK活性的调节。S1P是目前为止发现的唯一一种同时具有细胞内和细胞外双重功能的膜磷脂代谢产物。在细胞内,S1P是一个重要的第二信使,能动员Ca2+离子的释放和活化多种酶类;在细胞外,S1P可以通过与细胞表面特异性受体EDGs结合,活化多种信号通路,进而调节细胞的增殖、迁移和分化等多种生命活动。

我们的研究结果显示,K562/Ima细胞中ERK的磷酸化程度高于K562细胞。无论是对于K562细胞还是K562/Ima细胞,棘霉素都对ERK和AKT有不同程度的抑制作用。

综上所述,棘霉素不但能抑制K562细胞凋亡,也能抑制K562/Ima细胞的凋亡,IC50分别为0.82μg/L和0.87μg/L。机制可能与抑制ERK和AKT的磷酸化有关,对K562/Ima抑制作用可能还与抑制SPK的活性有关。另外,从实验中也可以看出伊马替尼的耐药机制可能与ERK的磷酸化程度高、SPK表达高有关,这也与前期的研究相一致[9],对棘霉素的研究有望为CML的治疗提供新的思路。

[1]安明榜.格列卫(甲磺酸伊马替尼)——一个里程碑式的发现[J].药学与临床研究,2010,18(2):101.

[2]John M,Goldman.Chronic myeloid leukemia-still a few questions[J].Experimental Hematology,2004,32:2―10.

[3]Olivera A,Kohama T,Tu Z,et al.Purification and characterization of rat kidneysphingosine kinase[J].J Biol Chem,1998,273:12576.

[4]Boulton T G,Yancopoulos G D,Gregory J S,et al.An insulin stimulated protein kinase similar to yeast kinases involved in cell cycle control[J].Science,1990,249 (4964):64―67.

[5]Boulton T G,Nye S H,Robbins D J,et al.ERKs:a family of proteinserine/threonine kinases that are activated and tyrosine phosphorylated inresponse to insulin and NGF[J].Cell,1991,65(4):663―675.

[6]Weinstein O,Oppenheimer C R,Blalock W L,et al.The raf signal transduction cascade as a target for chemotherapeutic intervention in growth factor responsive tumors[J]. Pharmacol Ther,2000,88(3):229―279.

[7]Steinmetz R,Wagoner H A,Zeng P,et al.Mechanisms regulating the constitutive activation of the extracellular signal regulated kinase(ERK)signaling pathway in ovarian cancer and the effect of ribonucleic acidinterference for ERK1/2 on cancer cell proliferation[J].Mol Endocrinol, 2004,18(10):2570―2582.

[8]Persad S,Attwell S,Gray V,et al.Regulation of protein kinase B/Akt serine 473 phosphorylation by integrin linked kinase:critical roles for kinase activity and amino acids arginine 211 and serine 343[J].J Biol Chem,2001, 276(29):27462―27469.

[9]许严伟,赵小利,王英等.伊马替尼敏感及耐药K562细胞P-糖蛋白、缺氧诱导因子和鞘氨醇激酶表达的比较[J].郑州大学学报(医学版),2012,47(2):153.

[责任编辑 时 红]

Effect of echinomycin on ERK，AKT and SPK expression between K562 and K562/Ima cells

XU Yanwei1，LIN Haihong2，DU Gangjun2*
（1.Depɑrtment of Phɑrmɑcy，Luoyɑng Third People's Hospitɑl，Luoyɑng，Henɑn 471002，Chinɑ；2.Phɑrmɑceutiɑl College，Henɑn University，Kɑifeng，Henɑn 475004，Chinɑ）

ObjectiveThis study was aimed to explore the effect of echinomycin on the K562 and K562/Ima cells.MethodsIn experiments，the cells proliferation was detected by MTT assay.ERK，AKT and SPK were examed by Western blot assay，TLC in K562 and K562/Ima cells，respectively.ResultsThe results revealed the IC50of echinomycin in K562 and K562/Ima were 0.82 mg/L and 0.87 mg/L，respectively.The ERK and AKT were inhited by echinomycin in K562 and K562/Ima.The expression of SPK was up-regulated in K562/Ima cells，and echinomycin on SPK activity in resistant cells had obvious inhibitory effect.ConclusionEchinomycin can inhibits the proliferation of K562 and K562/Ima cells，and its mechanism may be related to inhibition of ERK，AKT and SPK.

echinomycin；K562；resistance；ERK；AKT；SPK

R966

A

1672―7606(2015)04―0232―04

2015-10-30

国家自然科学基金资助项目(30472082)

许严伟(1981―),男,河南洛阳人,主管药师,从事肿瘤药理学及临床药理学研究工作。

*通信作者:杜钢军(1971―),男,河南开封人,博士,教授,从事肿瘤药理学研究工作。