棘霉素对耐伊马替尼K562细胞SPK及P-gp表达的影响

许严伟,林海红,杜钢军*

(1.洛阳市第三人民医院药剂科,河南洛阳471002;2.河南大学药学院,河南开封475004)

棘霉素对耐伊马替尼K562细胞SPK及P-gp表达的影响

许严伟1,林海红2,杜钢军1*

(1.洛阳市第三人民医院药剂科,河南洛阳471002;2.河南大学药学院,河南开封475004)

目的研究棘霉素对耐伊马替尼K562细胞SPK及P-gp表达的影响。方法MTT法检测细胞存活率,同位素掺入检测SPK的活性,流式细胞术检测细胞的P-gp表达。结果棘霉素对K562和耐伊马替尼细胞的IC50分别为0.82μg/L和0.87μg/L;棘霉素对耐药细胞中的SPK和P-gp活性有抑制作用;通过抑制SPK的活性可以下调P-gp的表达。结论棘霉素对敏感及耐药K562细胞均有较强的抑制作用,抑制K562/Ima存活的机制可能与影响细胞中SPK的表达,并通过下调SPK进一步影响P-gp的表达,从而增加药物在细胞内的累积浓度有关。

棘霉素;K562/Ima;鞘氨醇激酶;P糖蛋白

由多药耐药蛋白P糖蛋白P-gp介导的药物泵出增多、细胞内药物浓度降低在多种抗肿瘤药物耐药中得到证实,伊马替尼耐药的出现与P-gp也有着巨大的关系[1]。P-gp是一种相对分子质量为170 000U的跨膜糖蛋白,属于ABC转运蛋白家族成员之一。Juliano和Ling[2]首先在秋水仙碱耐药的中国仓鼠卵巢中发现P-gp,其主要作用是将药物或其他化学物质排出细胞外,防止机体对有害物质的吸收和介导物质的输出,从而保护大脑、睾丸、胎儿和骨髓等重要组织和器官。作为一种能量依赖性药物外排泵, P-gp通过ATP供能,将细胞内的药物泵出细胞外,从而降低细胞内药物浓度,既是机体生理状态下的自身防御保护机制,也是产生肿瘤多药耐药(Multidrug resistance,MDR)的主要原因之一[3]。

自Rhoads[4]首次描述MDR以来,肿瘤耐药已经涉及到临床常用的多种抗癌药物。TILLmer等[5]通过逐渐增加K562细胞中P-gp的表达来观察细胞内伊马替尼含量的变化,结果显示,随着P-gp表达的增强,细胞中伊马替尼的浓度呈现下降的趋势。证明了伊马替尼的耐药和P-gp有巨大的关系。

SPK-S1P信号通路是近年来被许多研究者所重视的一条有关细胞存亡、增殖的信号途径。鞘氨醇激酶(SPK)是一种高度保守的脂类激酶,它可激活鞘氨醇(Sp)而生成磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate,S1P)。细胞内S1P的水平受SPK活性的调节。S1P是一个与细胞多种功能有关的重要信号分子,具有多种生物学功能,包括促增殖作用、抗凋亡作用及诱导细胞迁移等[6]。

目前,SPK-S1P信号与K562细胞增殖、凋亡的关系以及与P-gp的关系没有很明确的报道。因此,本文旨在于观察棘霉素对SPK和P-gp的影响及探讨两者之间的关系。

1 材料和方法

1.1 材料

细胞株:K562细胞由本实验室保存,用时复苏; K562耐伊马替尼细胞(K562/Ima)购自中国医学科学院天津血液病研究所。K562和K562/Ima细胞用RPMI 1640培养基,于37℃、体积分数5%CO2恒温培养箱中培养,取对数生长期细胞用于实验。

主要试剂:兔抗山羊P-gp抗体(Sant Cruz公司产品);鞘氨醇、MTT、ATP(Sigma公司);其他试剂均为国产分析纯试剂。(γ-32P)ATP购自北京福瑞生物工程公司。

仪器:FACScalibur流式细胞仪,购自美国BD公司。

1.2 MTT检测

选择对数生长期的细胞,用含体积分数10%的胎牛血清培养基将细胞配成细胞浓度为(4～5)× 105/m L的细胞悬液,接种于96孔细胞培养板中, 180μL/孔,待细胞恢复生长状态后。各孔加入棘霉素20μL,使其终浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、3.0μg/L,并设空白对照组;K562组其终浓度分别0.03、0.01、0.1、0.3、1.0、3.0 mg/L,K562/Ima组分别为0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、20.0 mg/L。37℃继续培养48 h;弃掉培养基,每孔加入150μL DMSO,振荡15 min,570 nm波长检测光吸收值。以加药孔OD值与对照孔OD值的百分比为细胞存活率,根据细胞存活率和药物浓度的对应关系用SPSS软件求药物的IC50。

细胞的耐药倍数计算方法:

耐药倍数(RF)=耐药细胞(IC50)/敏感细胞(IC50)

1.3 SPK的活性检测[7]

不同浓度的棘霉素作用K562/Ima细胞12 h后(设空白对照组),收集细胞于缓冲液中,离心,冻融裂解3次;4℃,14 000 g离心20 min,收集上清;取180μL和10μL 1 mmol/L Sphingosine(溶解于体积分数为5%的Ttiton X-100中)混匀;加入10μL (32P)ATP(10μCi,20 mmol/L)含MgCl2200 mmol/L,37℃反应10 min;加入1 mol/L HCl 20μL和氯仿0.8 m L,氯仿∶甲醇∶HCl(体积比100∶200∶1),猛烈振荡,终止反应;加入氯仿60μL和2 mol/L KCl 60μL,12 000g离心5 min;此时水相和有机相分离,弃去水相,取15μL有机相样品点样于硅胶板上,于层析液中展开40 min;放射自显影;扫描结果,用图像分析软件Scionimɑge分析光密度。

1.4 细胞表面P-gp的检测

参照文献[6]进行,取对数生长期细胞收集于离心管中,1 000转离心5 min后用冰冷的PBS洗细胞2次;将细胞(5×105～1×106)沉淀重悬于50μL的PBS中,加入适当比例稀释的兔抗山羊P-gp抗体(10μL/管),4℃孵育1 h,期间间歇摇晃细胞;用含体积分数1%血清PBS洗细胞3次(每次加满离心管);将细胞沉淀重悬于50μL的PBS中,加入2.5μL稀释的FITC标记的二抗,4℃孵育40 min;将细胞沉淀重悬于250μL的PBS中,加入等体积的质量分数4%的多聚甲醛,混合均匀,保存于4℃冰箱,待流式检测用。至少检测10 000个细胞。

试验共分2组:第1组:向K562/Ima中加入棘霉素,使其终浓度为3.0μg/L,分别作用3、6、12、24、48 h。第2组:向K562/Ima细胞中加入SPK抑制剂DMS(N,N-dimethylsphingosine),0 u M(control),1.0 u M,2.5 u M和5.0 u M,处理12 h。

2 结果

2.1 K562/Ima相对于K562的RF

K562/Ima相对于K562的RF为24。棘霉素对K562细胞及K562/Ima细胞的IC50分别为0.82μg/L和0.87μg/L。对K562/Ima中SPK活性的影响,见图1。

图1 γ-32 P法检测K562/Ima细胞中SPK的活性

2.2 棘霉素对耐药细胞中P-gp表达的影响

在K562/Ima细胞试验组中,阳性对照组P-gp蛋白的表达细胞百分率为31.63%。棘霉素作用3、6、12、24、48 h后。Pgp蛋白表达细胞百分率分别被下调到8.69%、2.34%、1.33%、3.22%、8.66%,而敏感的K562细胞阴性对照组为0.3%,见图2。

2.3 SPK对K562/Ima细胞P-gp表达的影响

(见图3)

图2 棘霉素对K562/Ima细胞P-gp表达的影响

图3 加入SPK抑制剂后K562/Ima细胞中P-gp的表达

3 讨论

甲磺酸―伊马替尼(格列卫)作为靶向治疗慢性髓细胞性白血病(CML)的药物,曾被誉为抗癌药物史上里程碑的发现。但是,由于大部分患者对伊马替尼的应答期较短[8],随着伊马替尼作用时间的延长,耐药导致的治疗失败的现象越来越常见。耐药问题已经成为制约其临床应用的关键。因此,多药耐药产生的机制、寻找有效逆转方法和开发新的作用机制的药物是肿瘤研究的热点领域。

K562/Ima是耐伊马替尼的白血病细胞,也是研究临床耐药白血病的经典细胞模型。为了探讨棘霉素对K562/Ima细胞SPK和P-gp的影响,我们首先通过(γ-32P)掺入实验的方法,用不同浓度棘霉素(1.0、2.0、4.0μg/L)作用K562/Ima细胞12 h,结果发现在K562/Ima细胞中,随着棘霉素剂量的增加SPK的表达逐渐下降。与此同时,我们以流式细胞仪(FACS)的方法检测了棘霉素是否能降低耐药细胞中P-gp的表达。FACS定量分析结果显示,在K562/Ima细胞中, P-gp表达下降的趋势非常明显。阳性对照组P-gp蛋白的表达细胞百分率为31.63%。棘霉素作用3、6、12、24、48 h后。P-gp蛋白表达细胞百分率分别下调到8.69%、2.34%、1.33%、3.22%、8.66%,而不耐药的K562细胞阴性对照组为0.3%。由此可见,棘霉素可以很好地下调K562/Ima细胞中P-gp的表达。为了进一步探索P-gp和S1P之间是否存在关系,我们向细胞中加入了SPK抑制剂DMS,作用12 h后流式检测,结果发现,1.0μM的DMS已经对P-gp的表达起到了较好的下调作用,从25%下调到15%左右,加入5.0μM后下调到5.44%。

综上所述,由于棘霉素不但能下调K562/Ima细胞中SPK的表达,而且能显著下调耐药细胞中P-gp的表达,下调P-gp的机制可能是由SPK的介导调控产生的。这对于CML的耐药治疗及其机理的研究可能有较大的意义。

[1]朱焕玲,刘霆,孟文彤,等.体外诱导K562细胞伊马替尼耐药及其机理的初步探讨[J].四川大学学报(医学版), 2007,38(1):22―26.

[2]Juliano R L,Ling V.A surface glycoproein modulating drug permeability in Chinese hamster ovary cell mutants. Biochim Biophys Acta,1976,455(1):152―162.

[3]闻镍,张双庆,朱凌.P-糖蛋白最新研究进展[J].中国药事,2011,25(7):718―720.

[4]Rhoads C D.Nitrogen mustards intreatment of neoplastic disease[J].JAMA,1946,21:656―677.

[5]TIllmer,Mschaich U,Platzbecker,et al.P-glycoproteinmediated drug efflux is a resistance mechanism of chronic myelogenous leukemia cells to treatment with imatinib mesylate[J].Leukemia,2004,18:401―408.

[6]许严伟,赵小利,王英,等.伊马替尼敏感及耐药K562细胞P-糖蛋白、缺氧诱导因子和鞘氨醇激酶表达的比较[J].郑州大学学报(医学版),2012,47(2):153―155.

[7]Olivera A,Kohama T,Tu Z,et al.Purification and characterization of rat kidney sphingosine kinase[J].J Biol Chem,1998,273:12576.

[8]John M G.Chronic myeloid leukemia-still a few questions [J].Experimental Hematology,2004,32:2―10.

[责任编辑 时 红]

Effect of echinomycin on SPK and P-gp expression in K562/Ima cells

XU Yanwei1，LIN Haihong2，DU Gangjun1*
（1.Depɑrtment of Phɑrmɑcy，Luoyɑng Third People's Hospitɑl，Luoyɑng，Henɑn 471002，Chinɑ；2.Phɑrmɑceutiɑl College，Henɑn University，Kɑifeng，Henɑn 475004，Chinɑ）

ObjectiveThis study was aimed to explore the effect of echinomycin on SPK and P-gp in K562/Ima cells.MethodsIn experiments，thes cell proliferation was detected by MTT assay.SPK and P-gp were examed by TLC and FACSin K562/Ima cells，respectively.ResultsThe results revealed the IC50of echinomycin in K562 and K562/ Ima were 0.82μg/L and 0.87μg/L，respectively.The SPK and P-gp were inhited by echinomycin in K562/Ima. The expression of P-gp was inhibited by down-regulating the activity of SPK.ConclusionEchinomycin can inhibit the proliferation of K562 and K562/Ima cells，and its mechanism of inhibiting K562/Ima may be related to inhibition of SPK，and the expression of P-gp was inhibited by down-regulating the activity of SPK，further increasing cumulative concentration effect of drug in K562/Ima cells.

echinomycin；K562/Ima；SPK；P-gp

R966

A

1672―7606(2015)04―0240―04

2015-10-30

国家自然科学基金资助项目(30472082)

许严伟(1981―),男,河南洛阳人,硕士,主管药师,从事肿瘤药理学和临床药理学研究工作。

*通信作者:杜钢军(1971―),男,河南开封人,博士,教授,主要从事中药抗肿瘤药理学研究工作。