棘霉素对KBV200细胞作用的初步研究

许严伟,林海红,杜钢军*

(1.洛阳市第三人民医院药剂科,河南洛阳471002;2.河南大学药学院,河南开封475004)

棘霉素对KBV200细胞作用的初步研究

许严伟1,林海红2,杜钢军2*

(1.洛阳市第三人民医院药剂科,河南洛阳471002;2.河南大学药学院,河南开封475004)

目的初步研究棘霉素(echinomycin)对KBV200细胞(耐长春新碱的口腔癌细胞)的作用及其作用机制。方法采用MTT法及流式细胞仪分别检测KBV200细胞的增殖和凋亡;用同位素掺入、Western blot、RT-PCR等方法分别检测鞘氨醇激酶、P-糖蛋白、缺氧诱导因子的表达。结果棘霉素可诱导KBV200细胞的凋亡,流式结果出现DNA亚二倍体凋亡峰;棘霉素对鞘氨醇激酶、P-糖蛋白、缺氧诱导因子的表达有不同程度的抑制作用。结论棘霉素对KBV200细胞有细胞毒作用,其作用机制与抑制鞘氨醇激酶、P-糖蛋白、缺氧诱导因子的表达有关。

棘霉素;KBV200;鞘氨醇激酶;P-糖蛋白;缺氧诱导因子

肿瘤在人类死亡的主要疾病中居第2位,近年来发病率呈逐年上升趋势[1]。尽管目前已有多种治疗肿瘤的方法问世,由于肿瘤早期不易被发现的特点,化疗在肿瘤的治疗中一直处于主导地位。由于肿瘤细胞对化疗药物耐药性的产生,导致临床化疗药物的应用受到一定程度的影响。因此,开发或者研究新型的、能克服化疗耐药性的药物是现在肿瘤研究的热点之一。

棘霉素是从放线菌代谢物中分离得到的一种具有细胞毒作用的抗生素,它通过与DNA结合后可以抑制RNA的合成[2]。研究[3]表明,棘霉素对于多种肿瘤细胞均有抑制作用,例如黑色素瘤细胞及前列腺、中枢神经、结肠、乳腺、卵巢肿瘤细胞等。棘霉素对白血病细胞的生长已有报道[4],但棘霉素对耐长春新碱(Vincristine,CVR)KBV200的研究还未见报道。以我们实验室筛选的棘霉素(纯度＞92.3%,采用HPLC法)为研究对象,初步研究棘霉素对KBV200细胞的抗肿瘤作用及其作用机制,报道如下。

1 材料与仪器

1.1 细胞株

KBV200细胞由中国科学院生物物理研究所惠赠,用含体积分数10%胎牛血清和青霉素、链霉素各1×105U/L的RPMI 1640细胞培养液在37℃,体积分数5%CO2恒温培养箱中,实验时选用对数生长期的细胞。

1.2 试剂与药品

RPMI1640、MTT、ATP和鞘氨醇为Sigma产品;胎牛血清为杭州四季青公司产品;P-gp抗体为Sant Cruz公司产品;(γ-32P)ATP购自北京福瑞生物工程公司;其他试剂皆为国产分析纯试剂。

1.3 仪器

100级洁净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产);TDL-50B型台式离心机(上海安亭科学仪器厂生产);XD-101型倒置生物显微镜(南京江南光电集团股份有限公司);ELX800型酶标仪(美国BIO-TEK);FACScalibur流式细胞仪(美国BD公司);PCR仪和BIO-RAD垂直电泳仪(美国Bio-Rad公司)。

2 方法>

2.1 MTT检测

取对数生长期的KBV200细胞,用质量分数0.25%胰酶消化,调细胞数5×104个/m L, 100μL/孔接种于96孔板中,培养24 h后加含不同浓度棘霉素(设空白对照组)的培养基100μL/孔,每组6个复孔。48 h后,除去培养基,加MTT,含质量分数5 g/L的PBS 100μL/孔,继续培养4 h后除去孔内的液体,加入DMSO 100μL/孔,振荡10 min。在酶标仪上570 nm处测吸光度(OD),实验重复测算3次。按下列公式计算细胞的存活率:存活率(%)=给药孔平均OD值/对照孔平均OD值×100%。

2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡

取对数生长期KBV200细胞,用质量分数0.25%胰酶消化,调细胞数3×105个/m L,以3 m L/瓶接种于培养瓶中,培养24 h后加补充含不同浓度棘霉素的培养基3 m L/瓶,每组3个复瓶。48 h后终止培养,消化并收集细胞,PBS洗2次,体积分数70%冷乙醇固定30 min。PBS洗涤2次后加入Rnase酶消化10 min,1 500 r/min离心5 min,弃上清液,PBS重悬后加碘化丙锭(终浓度20 mg/L)染色15 min,流式细胞仪分析细胞凋亡。

2.3 γ-32P法检测SPK的活性

参照文献[5],收集细胞浓度约为5×106个/m L的KBV200细胞,离心后加入细胞裂解缓冲液,冻融裂解3次;4℃,14 000 g离心20 min,收集上清液,蛋白定量后取45μL样品和Sphingosine(溶解于质量分数5%Triton X-100中)混匀;在同位素室内加入2.5μL/管(32P)ATP(10μCi,20 mmol/L)37℃反应10 min;加入1 mol/L的HCl 5μL和氯仿0.2 m L,氯仿∶甲醇∶盐酸(体积比为100∶200∶1)剧烈振荡,终止反应。再加入氯仿60μL和2 mol/L氯化钾60μL,12 000 g离心5 min;弃去水相,取15μL有机相样品点样于硅胶底线上,于层析液中展开40 min左右;放射自显影;扫描结果,用图像分析软件(scion image)分析光密度。

紫杉醇近年来被广泛应用于乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌等恶性肿瘤治疗。但由于其过敏反应发生率较高，占39%，其中严重过敏反应发生率为2%，从而使治疗被迫中止，这样不仅影响了患者治疗，而且造成经济上严重损失。2010年1月—2011年4月我院门诊输液中心肿瘤患者在接受紫杉醇治疗过程中发生了多例过敏反应，其中34例过敏反应者，经对症处理与抗过敏治疗后，继续输注紫杉醇药液，顺利完成了化疗疗程。现将临床观察与护理报道如下。

2.4 Western Blot法检测P-gp蛋白

将从不同浓度棘霉素作用的KBV200细胞中提取的10μg蛋白样品用质量分数10%聚丙烯酰胺凝胶进行分离,并转移到PVDF膜上,进行免疫印迹分析。过程如下:用脱脂牛奶对膜进行封闭,加入1∶1 000稀释的抗P-gp山羊抗体,常温孵育2 h,用含体积分数0.1%Tween 20 TBS洗膜3次,加入1∶3 000稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊二抗,常温孵育45 min,用体积分数0.1%Tween 20 TBS洗膜3次,加入发光剂,曝光显影。

2.5 HIF-1αm RNA的表达

采用RT-PCR,用Trizol试剂分别提取不同棘霉素作用的KBV200细胞总RNA,逆转录为cDNA。目的基因HIF-1α与内参β-actin的引物由上海生工合成。HIF-1α引物序列:上游5’-TGAGGCTCACCATCAGTTAT-3’,下游5’-TAACCCCATGTATTTGTTC-3’,扩增产物为247 bp。β-actin引物序列:上游5’-AACCCTAAGGCCAACAGTGAAAAG-3’,下游5’-TCATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3’,扩增产物为261 bp。扩增条件:94℃变性5 min;94℃1 min, 50℃1 min,72℃2 min,循环35次;72℃延伸1 min,扩增产物经琼脂糖电泳后扫描成像[6]。

2.6 统计学方法

3 结果

不同浓度的棘霉素对体外培养的KBV200细胞有明显的增殖抑制作用,且抑制作用随药物浓度的增加而增加(见图1)。经棘霉素处理的细胞出现典型的亚二倍体/凋亡峰,随着药物浓度的升高,凋亡率逐渐增加。在棘霉素浓度为200μg/L时,细胞凋亡现象最为显著(见图2)。

图1 棘霉素对KBV200细胞的抑制作用

图2 棘霉素诱导的KBV200细胞凋亡

3.2 对SPK活性的影响

γ-32P法检测显示,随着棘霉素浓度的增加,对SPK的活性的影响逐渐增大(见图3)。

图3 棘霉素对SPK活性的影响

3.3 对P-gp蛋白活性的影响

Western Blot法检测P-gp蛋白显示,不同浓度棘霉素对KBV200细胞作用呈正相关关系(见图4)。

图4 棘霉素对KBV200细胞中P-gp蛋白的影响

3.4 棘霉素对KBV200细胞中HIF-1α的影响

T-PCR检测HIF-1αm RNA结果见图5。

图5 棘霉素对KBV200细胞中HIF-1α的影响

4 讨论

KBV200细胞是以对VCR敏感的KB细胞为亲本,通过诱变剂甲基磺酸乙酯(ethylmethane sulfonate)刺激,然后在培养液中加入浓度递增的VCR诱导而得。在VCR为200 nmol/L生长良好,对VCR耐药约是KB细胞的100倍。其耐药机制主要与P-gp过度表达有关[7],是研究多药耐药的经典细胞株。P-gp是一种相对分子质量为170 000U的跨膜糖蛋白,属于ABC转运蛋白家族成员之一。Juliano和Ling[8]首先在秋水仙碱耐药的中国仓鼠卵巢中发现P-gp,其主要作用是将药物或其他化学物质排出细胞外,防止机体对有害物质的吸收和介导物质的输出,从而保护大脑、睾丸、胎儿和骨髓等重要组织和器官。作为一种能量依赖性药物外排泵,P-gp通过ATP供能,将细胞内的药物泵出细胞外,从而降低细胞内药物浓度,既是机体生理状态下的自身防御保护机制,也是产生肿瘤多药耐药(Multidrug resistance,MDR)的主要原因之一[9]。

鞘氨醇激酶是一种高度保守的脂类激酶,它可激活鞘氨醇(Sp)而生成磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate,S1P)。细胞内S1P的水平受SPK活性的调节。S1P是一个与细胞多种功能有关的重要信号分子,具有多种生物学功能,包括促增殖作用、抗凋亡作用及诱导细胞迁移等[10]。缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)的活性主要取决于HIF-1α亚基的活性和表达,HIF-1α蛋白稳定性和转录活性主要受细胞内氧浓度的调节。是人体组织自动动态平衡的一个主要调节者。转录与细胞的存活、适应、无氧代谢、免疫反应、细胞因子分泌、血管生成等多种基因有关,尤其在肿瘤细胞的存活中有着重要的作用[11]。

我们选用KBV200细胞株为研究对象,观察不同浓度棘霉素处理后KBV200细胞生长抑制率和凋亡情况,以及对SPK、P-gp、HIF-1α表达的改变,结果显示,棘霉素对KBV200细胞的存活有较为明显的抑制作用,并可明显诱导KBV200细胞凋亡,不同浓度的棘霉素对KBV200细胞中的SPK、P-gp、HIF-1α均呈现抑制作用,并且棘霉素的抑制作用与其剂量呈正相关关系。

综上所述,棘霉素对KBV200细胞生长的抑制作用及其机制研究为解决口腔鳞癌对长春新碱的耐药提供了新的治疗方案,该实验仅仅是研究棘霉素作用机制的一部分,对肿瘤耐药的研究及探索工作正在进行中。

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[责任编辑 时 红]

The Primary research of Echinomycin on KBV200 cell line

XU Yanwei1，LIN Haihong2，DU Gangjun2*
（1.Depɑrtment of Phɑrmɑcy，Luoyɑng Third People's Hospitɑl，Luoyɑng，Henɑn 471002，Chinɑ；2.Phɑrmɑcologicɑl College of Henɑn University，Kɑifeng，Henɑn 475004，Chinɑ）

ObjectiveTo research the action and mechanism of echinomycin in KBV200 cell line.MethodsThe proliferation and cell cycle of KBV200 cells were determined by MTT assay and flow cytometry，respectively.TLC，Western-blot and RT-PCR were used to detect the expressions SPK，P-gp and HIF-1αon KBV200 cells，respectively.ResultsEchinoderm can induce apoptosis of KBV200 cells，and have different degrees of inhibition effect on expression of SPK，P-gp，HIF-1.ConclusionEchinomycin has better the cytotoxic effect on KBV200 cells，and the mechanism of action is related to inhibition of expression SPK，P-gp and HIF-1α.

echinoderm；KBV200；SPK；P-gp；HIF-1α

R966

A

1672―7606(2015)04―0236―04

2015-10-30

国家自然科学基金资助项目(30472082)

许严伟(1981―),男,河南洛阳人,主管药师,从事肿瘤药理学的研究工作。

*通信作者:杜钢军(1971―),男,河南开封人,博士,教授,从事肿瘤药理学研究。