不同负重抗阻训练对老年大鼠股四头肌蛋白质的影响

范锦勤，杜亚，翁锡全

(1．韶关学院体育学院，广东韶关 512005;2．广州体育学院，广东广州 510500)

2010年全国人口普查数据、2014年国民经济和社会发展统计公报数据［1－2］显示我国已进入了老年化社会，且老年人口的增长速度惊人。机体在增龄性衰老时容易发生“骨骼肌减少症”(Sarcopenia)，其将严重影响老年人的生活质量。Sarcopenia是在1988年由Rosenberg在学术会议上首次提出的，指随着年龄增加，骨骼肌质量、力量及功能逐渐下降的现象。典型的Sarcopenia表现为肌肉横截面积及体积下降，肌纤维类型比例发生变化，骨骼肌产生力量的能力下降［3］。Sarcopenia的发生是一个复杂过程，但现被认为其主要与骨骼肌质量控制失衡相关，包括蛋白质质量控制和肌纤维数目控制两方面［4－6］。有研究［7－8］显示长期抗阻训练可保持骨骼肌功能，减少Sarcopenia发生。还有研究者［9－12］认为年龄造成腺苷酸活化蛋白激酶(AMP－activated proteinkinase，AMPK)活性升高可能是抑制骨骼肌蛋白质合成的原因。本研究拟观察8周不同负重强度的抗阻训练对自然衰老大鼠股四头肌蛋白质总量和AMPK的影响，探讨负重强度和骨骼肌蛋白质之间的关系，明确AMPK活性对老年大鼠骨骼肌的影响。

1 材料与方法

1.1 动物分组与运动方案

于广东生物医学动物实验中心购买健康雄性SD大鼠40只，11月龄，体重(776.9±50)g。分笼饲养至18月龄，每笼3只，自由饮水，适量饮食(国家标准啮齿类动物常规饲料喂养)，室温23±2℃，湿度40% －60%，自然昼夜节律变化光照，保持通风。每天记录大鼠摄食饮水情况，每周记录大鼠体重。

参考翁锡全等［11］的跑台抗阻训练模型，将实验动物随机分为安静组AQ(n=8)，0%最大负重训练组AC(n=8)，30%最大负重训练组ASE(n=8)，50%最大负重训练组AME(n=8)和70%最大负重训练组ALE(n=8)。通过预实验获取各鼠的最大负重量(判断标准:在大鼠尾部施加负荷直至大鼠在驱赶下持续前行时间不超过5秒)，运动方式为尾部负重爬跑台运动，坡度 35°，跑速 15m/min，每次跑 15s，间歇休息 30s，循环 4次后休息3min，此为1组，跑3组为1个循环，每天运动2个循环，循环间歇为10min。适应性运动1周，正式运动从13:30开始，隔天1次，共8周。至实验结束时，AC组和ASE组大鼠均余7只，其余各组大鼠数量保持不变。

1.2 取材与样品制备

最后一次训练结束，所有大鼠禁食12h后称体重，使用10%水合氯醛(0.3g/kg．wt)腹腔注射麻醉，解剖大鼠取出股四头肌组织，用冷生理盐水漂洗去血液，滤纸吸干，锡箔纸包裹后即置于液氮中速冻，随后于－70℃冰箱保存。

从－70℃冰箱取出大鼠股四头肌样本，用电子天平称取1g肌肉组织，置于冰浴小烧杯用眼科剪剪碎，按1:9比例加入生理盐水，在0－4℃冰盒中用切割式匀浆器匀浆，制备成10%匀浆液，4℃下以2000prm离心10分钟，取上清液用于股四头肌组织指标测定。

1.3 测试指标与方法

大鼠股四头肌总蛋白含量测定使用考马斯亮蓝蛋白测定法，仪器为S22PC分光光度计;股四头肌AMPK含量测定使用酶联免疫吸附法(ELISA)，试剂盒购自南京建成生物工程研究所，仪器为RT－2100型多功能酶标仪。测试过程严格按照实验操作规范和试剂盒说明书进行，由专人操作完成。

1.4 统计学分析

采用SPSS15.0统计软件包进行统计，实验数据以均值±标准差±S)表示。显著性差异采用one－way ANOVA检验T检验和，显著性水平为P＜0.05，极显著性水平为 P＜0.01。

2 结果

2.1 不同负重抗阻训练对老年大鼠体重的影响

表1 8周不同负重抗阻训练过程中老年大鼠体重变化±S，g)

表1 8周不同负重抗阻训练过程中老年大鼠体重变化±S，g)

注:与 AQ组相比，*P＜0.05，＊＊ P＜0.01;与 AC 组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

AQ(n=8)AC(n=7)ASE(n=7)AME(n=8)ALE(n=8)训练前训练第3周末训练第6周末训练第8周末784.25±35.32 771.25±68.74 776.37±67.62 770.77±78.19 785.25±60.07 775.50±74.12 772.57±71.79 760.29±64.67 752.00±93.50 750.37±31.16 726.50±22.93 710.71±22.51 777.75±71.87 773.56±75.63 758.25±76.09 734.63±79.70 776.77±78.19 693.37±57.54*#676.75±62.70＊＊#658.50±33.34＊＊##

由表1可看出，与训练前相比，各组大鼠的体重在训练第8周末均出现了下降，提示随着年龄的增加，大鼠体重出现了一定程度的下降。不同负重的抗阻训练对体重的影响也较为明显，四组进行抗阻训练的大鼠在训练后的体重均较训练前下降，且体重的减少量随着负重重量的增加而增加。

与安静组(AQ)相比，各抗阻训练组大鼠体重下降更为明显，其中70%最大负重抗阻训练组(ALE)的体重在训练第3周末即出现了显著性差异(P＜0.05)，至训练第6周末其体重变化的差异更显著(P＜0.01)，其差异显著性保持至训练第8周末(P＜0.01)。与0%负重抗阻训练组(AC)相比，其余各负重抗阻训练组的体重下降与负重重量有关。负重重量越大，其体重减少越明显，其中70%最大负重抗阻训练组(ALE)的体重在训练第3周末即出现了显著性差异(P＜0.05)，其差异显著性保持至训练第6周末(P＜0.05)，至训练第8周末时，其体重变化的差异更具显著性(P＜0.01)。

2.2 不同负重抗阻训练对老年大鼠摄食量的影响

从表2可知，各组大鼠摄食量在8周不同负重抗阻训练前后并没有明显变化，但随着抗阻训练负重量的增加，大鼠摄食量稍有下降。

从表3可知，各组大鼠饮水量在8周不同负重抗阻训练前后并没有明显变化，但随着抗阻训练负重量的增加，大鼠饮水量稍有增加。

表2 8周不同负重抗阻训练过程中老年大鼠摄食量的变化(±S，g)

表2 8周不同负重抗阻训练过程中老年大鼠摄食量的变化(±S，g)

注:与 AQ 组相比，*P＜0.05，＊＊ P＜0.01;与 AC组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

AQ(n=8)AC(n=7)ASE(n=7)AME(n=8)ALE(n=8)训练前训练第3周末训练第6周末训练第8周末240.00±0.00 240.00±0.00 240.00±0.00 240.00±0.00 240.00±0.00 240.00±0.00 240.00±0.00 237.76±6.33 240.00±0.00 240.00±0.00 239.70±1.20 239.65±1.94 240.00±0.00 236.13±2.68 239.80±1.30 237.33±6.28 240.00±0.00 235.05±4.33 239.10±2.10 237.61±4.66

2.3 不同负重抗阻训练对老年大鼠饮水量的影响

表3 8周不同负重抗阻训练过程中老年大鼠饮水量的变化±S，ml)

表3 8周不同负重抗阻训练过程中老年大鼠饮水量的变化±S，ml)

注:与 AQ 组相比，*P＜0.05，＊＊ P＜0.01;与 AC组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

AQ(n=8)AC(n=7)ASE(n=7)AME(n=8)ALE(n=8)训练前训练第3周末训练第6周末训练第8周末360.71±20.56 377.92±10.14 438.65±16.97 412.60±12.56 435.70±26.46 314.33±15.86 339.36±7.09 348.20±12.55 383.56±16.93 370.05±20.06 386.45±13.82 388.43±12.06 382.91±26.64 364.37±14.40 407.17±11.55 399.89±11.78 377.14±27.06 380.06±21.26 403.64±11.43 393.07±12.85

2.4 不同负重抗阻训练对老年大鼠股四头肌总蛋白质含量的影响

表4 8周不同负重抗阻训练对老年大鼠股四头肌总蛋白质含量的影响(±S，g/L)

表4 8周不同负重抗阻训练对老年大鼠股四头肌总蛋白质含量的影响(±S，g/L)

注:与 AQ 组相比，*P＜0.05，＊＊ P＜0.01;与 AC组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

AQ(n=8)AC(n=7)ASE(n=7)AME(n=8)ALE(n=8)0.61±0.07总蛋白质定量 0.56±0.02 0.61±0.07 0.98±0.39*# 0.80±0.33*

由表4可知，8周不同负重抗阻训练后，与安静组(AQ)相比，各负重运动组大鼠的股四头肌总蛋白质含量均有增多，其中30%最大负重训练组(ASE)和50%最大负重训练组(AME)的总蛋白质含量增多具有统计学意义(P均＜0.05)。与0%最大负重训练组(AC)相比，30%最大负重训练组(ASE)的股四头肌总蛋白质含量升高具有统计学意义(P＜0.05)，50%最大负重组(AME)的总蛋白质含量稍有升高，70%最大负重训练组(ALE)的总蛋白质含量与AC组持平。

2.5 不同负重抗阻训练对老年大鼠股四头肌AMPK含量的影响

由表5可知，与安静组(AQ)相比，经过8周不同负重抗阻训练，各训练组大鼠的股四头肌AMPK含量均出现了上升，其中30%最大负重训练组(ASE)和50%最大负重训练组(AME)的AMPK含量增多具有统计学意义(P均＜0.01)。与0%最大负重训练组(AC)相比，30%最大负重训练组(ASE)和50%最大负重训练组(AME)的AMPK含量增多具有统计学意义(P均＜0.01)，70%最大负重训练组(ALE)的AMPK含量与AC组非常接近。

表5 8周不同负重抗阻训练对老年大鼠股四头肌AMPK含量的影响±S，ng/ml)

表5 8周不同负重抗阻训练对老年大鼠股四头肌AMPK含量的影响±S，ng/ml)

注:与 AQ组相比，*P＜0.05，＊＊ P＜0.01;与 AC 组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

AQ(n=8)AC(n=7)ASE(n=7)AME(n=8)ALE(n=8)144.23±13.50 AMPK含量 130.06±8.75 141.28±17.47178.25±21.68＊＊##185.42±13.70＊＊##

3 讨论

3.1 不同负重抗阻训练对老年大鼠体重、摄食量和饮水量的影响

流行病学调查显示，近13%的60岁以上老人受Sacopenia的影响，在80岁以上老人中则高达50%［13］。从表1可知，随着增龄的发展，老年大鼠的体重出现一定程度的下降，结合表2、表3的数据分析，在整个负重抗阻训练周期中，尽管大鼠的摄食量随着负重强度增加而略有下降，饮水量略有上升，但整体变化不大，说明老年大鼠体重的下降与摄食饮水之间并没有太大的关系，其体重下降极有可能是老年大鼠骨骼肌系统中蛋白质合成减少而分解增加所致，而负重抗阻训练对骨骼肌萎缩则有一定的作用。有研究证实［14］，伴随着机体衰老的发展，日常活动的机械刺激难以抵抗骨骼肌含量及功能的下降，但规律的抗阻训练能减缓该过程，成年人如果缺乏规律的抗阻练习，其50岁后的肌肉含量将以每年0.46kg的速度递减，在80岁时，仅Ⅱ型肌纤维丢失量就超过了50%。考虑70%最大负重训练组(ALE)的体重下降最为明显，推测可能是70%的最大负重量超出了老年大鼠所能承受的范围，加重了骨骼肌损伤有关。林文弢等［15］的研究也提出，低、中等负重抗阻训练对大鼠衰老过程腓肠肌凋亡调控基因的影响要好于大强度负重抗阻训练。

3.2 不同负重抗阻训练对老年大鼠股四头肌总蛋白质的影响

蛋白质合成减少、分解增加导致蛋白质大量丢失被认为是Sarcopenia的重要机制［16］。王顺利等［17］把老年人骨骼肌对较低浓度的氨基酸敏感性下降，蛋白质合成速率减弱的现象称作“蛋白质合成抵抗(Protein Synthesis Resistance)”。而骨骼肌总蛋白含量可从总体上反映骨骼肌蛋白质代谢的状况，对于评价骨骼肌的功能具有十分重要的作用［18］。从表4可知，抗阻训练对提高股四头肌总蛋白质含量效果明显，这种效果与不同负重重量间有密切的关联，其中30%和50%的最大负重量对增加总蛋白质的效果最好。这与林文弢等［15］的研究成果相一致，也提示合适的负重抗阻训练可减轻老年机体的蛋白质合成抵抗现象，有助于骨骼肌保持一定的蛋白质含量。正如Marzetti等［19］提出的，只有较大强度的力量训练才能增加骨骼肌蛋白合成，弱化衰老骨骼肌凋亡信号，从而阻止肌细胞大范围地进入凋亡程序而导致Sacopenia加剧，逆转老年人骨骼肌质量和力量下降。

3.3 不同负重抗阻训练对老年大鼠股四头肌AMPK含量的影响

AMPK可启动分解代谢途径，如脂肪酸氧化和糖酵解，从而增加ATP的产生，同时也关闭合成代谢途径，例如脂肪酸合成和蛋白质合成，从而减少ATP的消耗［20］。骨骼肌中 AMP含量升高是促进AMPK激活的主要因素。现有研究认为AMPK活性增加，可减少骨骼肌蛋白质合成或促进其蛋白质降解。马延超等［21］发现，一次性大强度耐力运动后1－6 h，骨骼肌蛋白质降解可能增强，其原因可能是 AMPK活化，促进了 MAFbx mRNA、MuRF1 mRNA基因表达。Thomson等［9］用老年大鼠和成年大鼠为实验对象，进行机械刺激促使大鼠肌肉肥大，观察到随着年龄增大，大鼠快肌肥大情况随之下降而其中的AMPK活性反而增加;大鼠慢肌纤维随着年龄增大，其肥大情况及其中的AMPK活性均没有差异。其认为年龄造成AMPK活性的升高可能是造成快肌肥大程度减弱的原因。Nakashima等［10］的研究也认为AMPK活化刺激了C2C12肌管中肌纤维蛋白的降解。

分析本研究的实验数据，与安静组(AQ)相比，不同负重抗阻训练后老年大鼠股四头肌的AMPK含量均有上升，且不同的负重强度组别其AMPK含量不同，提示抗阻训练可以激活AMPK，这种激活与负重强度有一定的关系。而无论是与安静组(AQ)比较，还是与0%最大负重抗阻训练组(AC)组比较，老年大鼠股四头肌的AMPK含量在30%和50%最大负重抗阻训练组(ASE和AME)中均有显著性升高(P＜0.01)，这与股四头肌总蛋白质含量水平相一致，提示着在本研究中，AMPK活性的增加并没有引起相关骨骼肌蛋白质的过多降解，考虑这可能是运动对蛋白质合成及降解的调控表现出了一定的矛盾性。邱守涛等［22］实验发现，运动既可通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的活性促进蛋白合成，又可通过AMPK/Sirt1信号通路增强泛素－蛋白酶体系统及细胞自噬功能，并抑制mTOR活性促使蛋白降解。由于70%最大负重抗阻训练组(ALE)的股四头肌AMPK含量与0%最大负重抗阻训练组(AC)组接近，其总蛋白质含量也基本一致，考虑过大的负重强度并不利于蛋白质的合成，也可能与运动强度过大导致自噬抑制有关。于亮等［23］指出能量消耗仅能在一定程度上调控自噬水平变化，最佳的自噬水平表达可能为低强度运动。

4 结论

随着机体的增龄发展，骨骼肌可能出现萎缩现象，引会机体体重下降，影响机体正常生理功能。8周不同负重量抗阻训练可有效抵抗骨骼肌由于衰老而引起的肌肉减少情况，提高老年大鼠股四头肌总蛋白质的含量，且30%和50%最大负重量抗阻训练的效果更为明显。70%最大负重量的抗阻训练可能由于强度过大，加重了骨骼肌细胞损伤，不建议在老年机体中采用。本研究中老年大鼠股四头肌的AMPK含量变化与相关肌肉的总蛋白质含量一致，提示运动对蛋白质合成及降解的调控表现出一定的矛盾性，具体机制尚需进一步研究探讨。

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