应用SSA报告载体提高ZFN和CRISPR/Cas9对猪IGF2基因的打靶效率

吴金青，梅瑰，刘志国，陈瑶生，丛佩清，何祖勇

1. 中山大学生命科学学院，有害生物控制与资源利用国家重点实验室，广州 510006；2. 广东省农业科学院动物科学研究所，畜禽育种国家重点实验室，广州 510640

应用SSA报告载体提高ZFN和CRISPR/Cas9对猪IGF2基因的打靶效率

吴金青1，梅瑰2，刘志国1，陈瑶生1，丛佩清1，何祖勇1

1. 中山大学生命科学学院，有害生物控制与资源利用国家重点实验室，广州 510006；
2. 广东省农业科学院动物科学研究所，畜禽育种国家重点实验室，广州 510640

IGF2(Insulin-like growth factor 2)基因作为最复杂多样的生长因子之一，对猪胎儿发育以及出生后生长发育和肌肉生成起着非常重要的作用。通过基因组编辑技术对我国本地猪种的IGF2基因作精确的遗传修饰，对于提高本地猪种的瘦肉率具有重要的育种意义。文章在蓝塘猪胎儿成纤维细胞(Porcine fetal fibroblasts, PEF)中检测了锌指核酸酶(Zinc finger nucleases, ZFN)和CRISPR/Cas9对IGF2基因的打靶效率，结果表明CRISPR/Cas9 对IGF2基因的切割效率最高可达9.2%，显著高于ZFN的切割效率(<1%)，但两者均未达到作为体细胞核移植(Somatic nuclear transfer, SCNT)供体细胞所需的打靶效率。应用SSA (Single-strand annealing)报告载体筛选技术来富集IGF2基因被ZFN和CRISPR/Cas9修饰过的PEF细胞，结果表明，该技术可使CRISPR/Cas9的打靶效率提高5倍左右，对ZFN的打靶效率具有更大的增强作用。

IGF2基因；ZFN；CRISPR/Cas9；SSA报告系统

胰岛素样生长因子2(或者类胰岛素生长因子2) (Insulin-like growth factor 2, IGF2)[1]，又称为生长调节素(Somatomedin A)，是目前所知功能最复杂多样的生长因子之一。作为一种胚胎生长因子，IGF2不仅在胎儿的生长发育中发挥重要作用，同时也是一种促有丝分裂肽，对机体的正常生长发育有重要作用，并能刺激肿瘤细胞的增殖。研究表明，猪IGF2基因内含子3的3072[2]位点发生单碱基突变(G→A)会引起 IGF2基因的抑制因子 ZBED6[3]的蛋白表达量下调，进而提高IGF2基因的表达水平，对促进猪肌肉形成具有重要调控作用。该位点的突变与瘦肉率存在相关性，可增加3%～4%的瘦肉量。通过近年来迅速发展的基因组编辑技术对本地猪种的 IGF2基因内含子3的3072位点进行精确的G→A点突变操作，在基因组中不引入任何其他的外源DNA序列，这样可以使本地猪种保持基因组的“纯度”，最大限度地保留了其肉质优良、口感好等优良性状，又能特异地提高其瘦肉率，对于改良和利用本地猪种资源具有重要的育种意义。

通过传统的同源重组方法获取基因打靶猪不仅工作量大而且效率低下。基因组编辑技术包括锌指核酸酶技术[4](Zinc finger nucleases, ZFN)、TALEN (Transcription activator-like effector nucleases)技术[5]以及 CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9[6, 7]技术的出现，极大地提高了基因定点修饰的效率和精确性。其中 ZFN和TALEN都是蛋白导向型的基因组编辑技术，前者通过一种锌指蛋白结构识别基因组序列，后者通过转录因子类似物蛋白识别基因组序列，两者都是借助FokⅠ核酸内切酶对靶基因进行非特异性切割的基因组编辑技术。与ZFN和TALEN不同，CRISPR/Cas9技术是一种RNA导向型的基因组编辑技术[8]，是由细菌和古生菌中一种被称为 CRISPR/Cas的获得性免疫系统改造而来。CRISPR位点由一系列保守的重复序列组成，重复序列之间被短的间隔序列(Spacer)隔开。依靠该免疫系统，细菌或古细菌中 Cas核酸酶将入侵的外源DNA切割成小片段，作为间隔序列整合到自身基因组中的 CRISPR位点上，随后以间隔序列作为模板转录出相应的 CRISPR RNA (crRNA)，crRNA 进一步与 trans-activating crRNA (tracrRNA)结合形成 tracrRNA:crRNA复合体，用来引导 Cas核酸内切酶降解入侵的噬菌体或质粒[9]。通过人工设计，可以将tracrRNA和crRNA这两种RNA改造形成具有引导作用的sgRNA (short guide RNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割。sgRNA可以构建到带有U6启动子的载体上，可在哺乳动物细胞中获得表达。构建不同的sgRNA表达载体时，只需要替换其中20 bp的gRNA序列即可，而不像ZFN和TALEN，需要重新设计和组装与DNA结合的蛋白序列，使CRISPR/Cas9技术具有操作更加简便和成本更低的优势。上述3种基因组编辑技术使基因定点遗传修饰变得相对简单高效，不仅被应用于制备小鼠和斑马鱼等模式动物基因敲除模型[8]，而且已经成功地用于制备基因敲除猪[10]。

目前应用基因组编辑技术制备基因敲除猪主要有两种途径。第一种方法是将表达ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9的mRNA通过显微注射的方法[10]注入猪原核期受精卵当中，再通过胚胎移植的方法获得基因敲除猪；第二种方法是先制备基因敲除猪胎儿成纤维细胞系(Porcine fetal fibroblasts, PEF)，然后通过体细胞核移植的方法获得基因敲除猪。第一种方法可以较为快速地获得基因敲除猪，但是基因敲除猪的遗传修饰类型、性别和遗传背景难以控制；而采用第二种方法，不仅可以预先确定遗传修饰类型和性别，而且可以获得遗传背景完全一样的基因敲除猪。虽然ZFN和CRISPR/Cas9具有较强的基因组编辑能力，但是多数情况下，它们的活性往往不够高，影响获取基因敲除的PEF细胞系。因此，需要一种方法可以有效筛选基因组已被修饰过的细胞。在HEK293等永生细胞系中，通过应用SSA(Single-strandannealing)报告载体[11]以及 Surrogate报告载体[12]可以有效富集基因组被ZFN和TALEN修饰的细胞。但是目前还未见关于在PEF等原代细胞中应用该技术的报道。

本研究在PEF细胞中比较了ZFN和CRISPR/Cas9对猪IGF2基因打靶效率，并分析了这两种基因组编辑技术介导的基因修饰类型的差异性。通过构建SSA报告系统，利用 T7EⅠ实验和TA克隆测序分析方法证明该报告系统可以显著提高 ZFN和CRISPR/Cas9对猪IGF2基因的打靶效率，为今后获取IGF2定点修饰猪进行了有益探索。

1 材料和方法

1.1 材料

蓝塘猪胎儿成纤维细胞由实验室分离建立。PX330 (sgRNA/Cas9表达质粒)购自Addgene(北京中原公司代理，货号：#42230)。pEGFP-SSA载体由实验室构建保存。

1.2 方法

1.2.1 IGF2基因靶位点选择

根据IGF2基因序列从Sigma公司定制3对靶向IGF2的ZFN。在3对ZFN识别序列范围内，根据sgRNA基本设计原则(序列符合5′-GN19NGG-3′)，并借助软件分析(http://crispr.mit.edu/)，设计 5条靶向猪IGF2基因的sgRNA，具体序列见表1。

表1 靶向IGF2基因gRNA序列信息

图1 Cas9与sgRNA共表达载体图谱(PX330载体)

1.2.2 猪IGF2基因sgRNA/Cas9打靶载体的构建

PX330载体可同时表达sg RNA和密码子经人源性优化的Cas9蛋白(图1)。根据表格1中所设计的5条sgRNA，合成相应的寡核苷酸正负单链，每条单链上添加有相应的黏性末端。用BbsⅠ(NEB公司)酶切1 μg PX330载体，线性化的质粒经电泳后，通过胶回试剂盒(OMEGA公司)回收酶切载体。同时，对正负两条寡核苷酸链进行复性和磷酸化处理，使之形成具有黏性末端的双链DNA短片段。将上述短片段和线性化的PX330载体通过T4连接酶进行连接反应，接着转化至 DH5α感受态细胞中。最后挑选细菌单克隆，通过测序鉴定sgRNA表达载体是否构建成功。

1.2.3 PEF细胞培养与转染

PEF细胞从蓝塘猪胎儿中分离建立。PEF细胞在含有20%胎牛血清和双抗(100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素)的 DMEM培养基中生长。细胞培养 1～2 d后更换一次培养基。PEF细胞生长至80%左右的汇合度时，先用PBS洗涤两遍，然后用胰酶消化2 min，随后加入血清终止消化，将消化后的细胞收集至15 mL的离心管进行离心，弃上清后再用PBS洗涤一遍进行第二次离心。离心后弃上清，然后用适量Buffer R (Life Technology)溶液重悬细胞，使细胞密度达到1.0×107个细胞/mL，使用 Neon™ 转染系统(Life Technology)对PEF细胞进行电击转染。转染条件为：1700 V电压，脉冲20 s，脉冲次数为1次。细胞转染后24 h更换培养基，添加双抗，在5%的CO2、37℃条件下进行培养。3 d后进行流式分析、分选或者收取细胞提取DNA进行后续实验。

1.2.4 T7EⅠ实验

T7核酸内切酶Ⅰ(T7EⅠ酶)可以用来检测由ZFN或者CRISPR/Cas9介导的基因突变，实验方法参照文献[12]。PEF细胞在转染后3 d，或者是经分选后再培养一周，使用组织/细胞提取试剂盒(OMEGA公司)提取细胞基因组，通过PCR扩增出包含ZFN 和CRISPR/Cas9识别位点的长度为663 bp的IGF2基因片段，采用Axgen PCR清洁试剂盒(Axgene公司)纯化PCR产物。纯化后的PCR产物先在高温下变性，然后经逐步降温退火形成异源双链DNA，使用T7EⅠ对上述产物进行酶切，如果ZFN或CRISPR/ Cas9有活性，会产生460 bp和203 bp的两个片段，可以在聚丙烯酰胺胶中分辨出来。最后通过Image J软件计算ZFN和CRISPR/Cas9的切割效率，估算其活性。PCR扩增IGF2基因的引物如下：

1.2.5 测序分析

利用LA Taq酶(TaKaRa公司)扩增出包含ZFN 和sgRNA所识别位点的IGF2基因片段，利用琼脂糖凝胶电泳分离该片段，然后用胶回试剂盒(OMEGA公司)回收，将回收的片段克隆到pMD18-T载体(TaKaRa公司)中，转化后挑选若干个单菌落，由上海英骏公司进行测序分析。

1.2.5 IGF2-SSA报告载体构建及SSA实验原理

pEGFP-SSA骨架载体上两段F重复片段的中间存在 XhoⅠ和 BamHⅠ两个酶切位点(图 2A)，先用这两种内切酶对骨架载体进行双酶切，并回收载体骨架片段。合成含有ZFN和sgRNA识别位点的两条互补的寡核苷酸单链，经高温变性和复性后形成两端分别带有 XhoⅠ和 BamHⅠ两个酶切位点粘性末端的短片段，克隆到 pEGFP-SSA骨架载体，构建IGF2-SSA报告载体。SSA报告系统的检测原理如下：当报告载体上的EGFP基因的中间片段(F片段)发生重复时，报告载体无法表达出正常的EGFP蛋白。此时在两个F片段中间插入IGF2基因的sgRNA或ZFN的识别位点后，在Cas9或ZFN对报告载体进行切割产生双链断裂后，细胞会通过单链退火(Singlestrand annealing, SSA)的修复机制，利用同源序列互补重构出完整的EGFP基因(图2B)，恢复荧光表达。此时，通过检测细胞的绿色荧光水平可以对sgRNA/Cas9或ZFN的活性进行评估。

图2 IGF2 SSA实验原理

1.2.6 流式细胞分析与分选

先用2%的胰蛋白酶消化贴壁的PEF细胞，然后用PBS重悬成单个细胞，经50 μm尼龙膜过滤到流式管中，在 FACScalibur流式细胞分析仪上分析细胞的荧光比例与强度。应用FACSAria II流式细胞分选仪器分选出EGFP阳性细胞，接种至12孔板中继续培养。

2 结果与分析

2.1 靶向猪IGF2的CRISPR/Cas9在PEF细胞中的活性验证

将构建好的5条IGF2-sgRNA分别与IGF2-SSA共转染至PEF细胞中，48 h后检测细胞内的EGFP荧光表达情况，并通过流式细胞分析术对表达EGFP的细胞比例进行定量，初步评估5条sgRNA的活性。结果表明，5条sgRNA均有活性，其中IGF2-sgRNA-2 和IGF2-sgRNA-4的活性最高(图3)，EGFP荧光比例与只转染SSA报告载体的对照相比，都提高了6.5倍。

图3 利用SSA方法对IGF2-sgRNA活性评估

2.2 T7EⅠ酶切检测靶向 IGF2基因 sgRNA/Cas9的活性

分别将5条靶向IGF2基因的sgRNA质粒通过电转染方法转染PEF细胞中，48 h后收集细胞，提取基因组DNA，通过PCR扩增IGF2基因片段，通过T7EⅠ突变检测方法，进一步验证IGF2-sgRNA的活性。从图4中可以看出，除了IGF2-sgRNA-5未能检测到460 bp和203 bp酶切条带，其余4条sgRNA均可见相应的酶切条带，它们的活性分别估算为5.1%、2.7%、7.8%和9.2%。其中IGF2-sgRNA-4的估算活性最高，与SSA检测的结果相符。

图4 T7E1酶切法检测靶向猪IGF2基因的CRISPR/ Cas9活性

2.3 SSA报告载体法富集被 ZFN与 sgRNA/Cas9修饰过的细胞

为了更好地比较 SSA方法对提高 ZFN和CRISPR/Cas9的打靶效率是否存在差异，本研究选择IGF2-sgRNA-1与IGF2-ZFN-set3作为比较对象，因为两者的靶位点基本重合(图5A)。流式分析结果显示，IGF2-sgRNA-1可以使 5.2%的细胞中的IGF2-SSA报告载体恢复EGFP荧光表达，明显高于IGF2-ZFN-set3介导1.5%的细胞表达EGFP(图5B)，这表明在该位点上，CRISPR/Cas9的打靶效率明显高于ZFN。同时，通过T7EⅠ突变检测方法分别在分选前和分选后的细胞中检测CRISPR/Cas9和ZFN的切割效率，结果发现在分选前的细胞中，IGF2-sgRNA-1切割的效率为1.6%，而在分选后的细胞中，其切割效率提高至9.3%，这表明SSA报告载体方法可以使CRISPR/Cas9的打靶效率提高5倍左右(图5C)。而 IGF2-ZFN-set3分选前的细胞中切割效率低于检测下限(<1%)，而在分选后的细胞中提高至 5.1%，这提示SSA报告载体方法对低活性的ZFN具有更明显的提高打靶效率的作用。

图5 SSA富集ZFN与CRISPR/Cas9基因修饰细胞实验

2.4 TA克隆测序分析富集效率和突变类型

TA克隆结果如表2所示。在转染IGF2-sgRNA-1+SSA后，以分选前的细胞基因组为模板扩增获得的50个PCR克隆中，发生突变的有6个，打靶效率为 12%；从分选后细胞基因组为模板扩增获得的48个PCR克隆中，发生突变的有7个，打靶效率为16.7%。这表明SSA报告载体方法可使CRISPR/Cas9的打靶效率提高至1.4倍。对于IGF2-ZFN-set3+SSA，从分选前的细胞基组为模板扩增获得的 60个 PCR克隆中未检测到发生突变的克隆，而从分选后的细胞基因组为模板扩增获得的30个PCR克隆中，检测到发生突变的克隆为 5个，打靶效率为 16.7%。与通过T7EⅠ突变检测的结果相一致，SSA报告载体方法对低活性的ZFN具有更明显的提高打靶效率的作用。

此外，对测序结果进行统计分析，本研究发现CRISPR/Cas9和ZFN在猪IGF2基因引起的敲除片段大小和突变类型存在差异。从图6的测序结果可以看出，CRISPR/Cas9对猪 IGF2基因可以引起达123 bp的缺失，而ZFN对该基因引起的敲除片段都小于50 bp，说明CRISPR/Cas9可能更容易引起较大片段缺失。另外，ZFN在IGF2基因引起80%的缺失突变，其余 20%的突变为既有缺失又有插入的复合突变；而CRISPR/Cas9对IGF2基因的同个位点造成的突变类型中，插入突变高达 50%，而缺失突变仅占30%，复合突变占20%(与ZFN相似)(图7)。这两种基因组编辑工具引起基因突变类型存在差异可能与两者所使用的非特异性内切酶引起双链DNA断裂末端不同相关，其中ZFN的FokⅠ内切酶在切割DNA后会产生粘性末端，而Cas9切割DNA后会留下平末端。

表2 T7EⅠ实验和TA克隆实验对靶向猪IGF2基因sgRNA和ZFN的效率统计

图6 TA克隆测序分析

图7 ZFN与CRISPR/Cas9介导IGF2基因突变类型的比较

3 讨 论

ZFN是最早出现的基因组编辑工具，在家畜基因敲除研究中已经得到了较多的应用。Yang等[13]研究发现，采用新霉素(G418)筛选之后ZFN在PEF细胞中对猪 Ppar-γ基因的打靶活性仅有 4%，而Watanabe等[14]利用ZFN对猪IL2RG进行基因敲除研究中，ZFN在 PEF细胞中的打靶效率更低仅为0.5%。上述两个研究中基因敲除猪的获得都是通过挑选单细胞克隆方法筛选出基因敲除的细胞系用于体细胞克隆。Hauschild等[15]利用ZFN对猪GGTA1基因敲除研究中，在PEF细胞中活性也较低，仅有1%，由于该基因表达与膜蛋白有关，该课题组通过借助相应的抗体采用磁珠分选的方法获取了基因敲除细胞。从上述相关研究中可以看出ZFN在猪PEF细胞中的打靶效率相对比较低，获取敲除细胞系的难度较大。CRISPR/Cas9作为最新的基因编辑工具，具有更加高效简便的特点。2014年，周琪课题组通过受精卵显微注射CRISPR/Cas9 mRNA的方法，获得了vWF基因敲除猪，单等位基因的敲除效率高达68%，双等位基因敲除效率也达到了37%[10]。尽管采用受精卵显微注射CRISPR/Cas9 mRNA的方法获取基因敲除猪具有较高的效率，然而也存在一定的缺陷，比如利用该方法无法在基因敲除猪出生前确定其性别及基因修饰的情况。目前尚未见关于CRISPR/Cas9技术在PEF细胞中进行基因打靶，进而用于体细胞克隆的研究报告。

本研究利用ZFN和CRISPR/Cas9对猪IGF2基因进行了定点敲除相关研究，并通过SSA方法提高了ZFN和CRISPR/Cas9对猪IGF2基因的打靶效率。研究表明，从Sigma公司购买的3对ZFN在PEF细胞中的活性均偏低，都无法通过T7EⅠ检测出来，这与靶向猪IL2RG基因[14]和GGTA1基因[15]分别只有0.5%效率和1%的效率相一致。因而，本文构建了靶向该基因的5条sgRNA，分别通过SSA方法和T7EⅠ评估了它们的活性，其中活性最高的 IGF2-sgRNA-4切割效率接近10%。本研究结果表明，CRISPR/Cas9对猪IGF2基因的敲除效率要高于ZFN。然而CRISPR/ Cas9在其他物种中的打靶效率可以达到80%以上[8]，在显微注射过的猪受精卵中的打靶效率也达到68%，此外本实验室发现CRISPR/Cas9对猪其他基因，如BMP15基因敲除效率也可以达20%以上(未发表)。本文认为在PEF细胞中，CRISPR/Cas9对IGF2基因的打靶效率不够高的原因可能有两个方面：(1)PEF细胞转染效率相比于其他细胞系如HEK293FT细胞较低；(2)IGF2基因结构较为复杂，GC含量很高，甲基化程度高，所设计的每条sgRNA的GC含量都在70%以上，可能会影响其与靶位点的结合。因为ZFN和CRISPR/Cas9对猪IGF2基因的打靶效率都偏低，所以需要有效的方法提高它们的打靶效率。韩国科学家利用 Surrogate报告载体筛选方法在HEK293FT细胞中可以将ZFN对TP53基因的打靶效率提高13倍[12]，其他相关研究通过SSA报告载体筛选[11]的方法也可以在HEK293FT和HeLa等细胞系中将ZFN介导的基因修饰效率提高至不同的程度，但目前尚未见关于在PEF细胞等原代细胞中应用这些筛选方法来提高基因打靶效率的报道。

本研究应用SSA报告系统，在PEF细胞中检测了其对靶向猪IGF2基因的ZFN和sgRNA是否具有提高打靶效率的作用，结果表明SSA报告系统均可显著提高两种基因组编辑工具的打靶效率，而且对低活性的 ZFN的提高效果更为明显(表 2)。本研究应用SSA报告系统，在PEF细胞中只经过一轮细胞筛选，在Surrogate报告载体方法中提到采用两轮细胞筛选的方法可以进一步提高 ZFN的打靶效率[12]，因此，今后可通过两轮细胞筛选方法进一步提高ZFN或CRISPR/Cas9对猪IGF2基因的打靶效率，为获取IGF2基因定点修饰的蓝塘猪提供研究基础。

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(责任编委: 张 博)

Improving gene targeting efficiency on pig IGF2 mediated by ZFNs and CRISPR/Cas9 by using SSA reporter system

Jinqing Wu1, Gui Mei2, Zhiguo Liu1, Yaosheng Chen1, Peiqing Cong1, Zuyong He1
1. State Key Laboratory of Biocontrol, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510006, China; 2. Institute of Animal Science, Guangdong Academy of Agricultural Sciences; State Key Laboratory of Livestock and Poultry Breeding, Guangzhou 510640, China

IGF2 (Insulin-like growth factor 2) is a major growth factor affecting porcine fetal and postnatal development. We propose that the precise modification of IGF2 gene of Chinese indigenous pig breed——Lantang pig by genome editing technology could reduce its backfat thickness, and increase its lean meat content. Here, we tested the genome editing activities of zinc finger nucleases (ZFNs) and CRISPR/Cas9 system on IGF2 gene in the Lantang porcine fetal fibroblasts (PEF). The results indicated that CRISPR/Cas9 presented cutting efficiency up to 9.2%, which was significantly higher than that generated by ZFNs with DNA cutting efficiency lower than 1%. However, even by using CRISPR/Cas9, the relatively lower percentage of genetically modified cells in the transfected popula-tion was not satisfied for somatic nuclear transfer (SCNT). Therefore, we used a SSA (Single-strand annealing) reporter system to enrich genetically modified cells induced by ZFN or CRISPR/Cas9. T7 endonuclease I assay revealed that this strategy improved genome editing activity of CRISPR/Cas9 by 5 folds, and was even more effective for improving genome editing efficiency of ZFN.

IGF2 gene; ZFN; CRISPR/Cas9; SSA reporter system

2014-06-19;

2014-08-29

国家转基因重大专项(编号：2013ZX08006005-005)和国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(编号：2010CB945404)资助

吴金青，硕士研究生，专业方向：生物工程。E-mail: jinqingw@163.com

何祖勇，博士，讲师，研究方向：动物遗传与育种。E-mail: zuyonghe@gmail.com

10.16288/j.yczz.2015.01.008

时间： 2014-10-15 8:07:28

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20141015.0807.003.html