成骨不全Ⅰ型家系的基因检测和COL1A2基因新突变的致病性鉴定

李荣，郭源平，潘敬新，郭奕斌

1. 中山大学中山医学院医学遗传学教研室，广州 510080；2. 中山大学医学遗传室业余科研小组/广州市第十六中学高二(3)班，广州 510080；3. 福建医科大学附属第二医院内科，泉州 362000

成骨不全Ⅰ型家系的基因检测和COL1A2基因新突变的致病性鉴定

李荣1，郭源平2，潘敬新3，郭奕斌1

1. 中山大学中山医学院医学遗传学教研室，广州 510080；2. 中山大学医学遗传室业余科研小组/广州市第十六中学高二(3)班，广州 510080；3. 福建医科大学附属第二医院内科，泉州 362000

为了揭示成骨不全(Osteogenesis imperfecta, OI)Ⅰ型家系的分子遗传学发生机制，文章采用PCR-DNA直接测序法，对患儿COL1A1和COL1A2基因共103个外显子(E)进行突变检测。结果显示：患儿COL1A1基因未发现任何病理性突变，而在COL1A2基因E19内发现一新的杂合错义突变(p.G316C)，该突变来自其父，而其母正常，其他表型正常的 6位亲属也均未发现该突变；通过 DHPLC(Denaturing high performance liquid chromatography)筛检，发现患儿与其父均有异常双峰，而其母和所有正常对照均为正常单峰；通过ASA(Allele specific amplification)筛检，患儿与其父均有391 bp的特异扩增带，而其母和所有正常对照均未见特异扩增带；保守性分析结果显示，该突变位点所在甘氨酸在进化上具有高度保守性；SIFT和PolyPhen-2软件预测结果显示，新突变造成的结果是“有害的”和“很可能有害”。上述结果均说明 COL1A2基因c.946G>T/p.G316C新突变是导致OI-Ⅰ型的致病性突变，是引起患儿发病的真正内因。患儿父母若再次孕育，可在孕早期进行产前基因诊断或孕前期进行PGD(Preimplantation genetic diagnosis)予以防患。

成骨不全Ⅰ型；C0L1A2基因；新突变；致病性鉴定

成骨不全(Osteogenesis imperfecta, OI)又称为脆骨病，是一种全身结缔组织遗传病，常见的、经典的 OI呈常染色体显性遗传(Autosomal dominant, AD)，而罕见的、新发现的呈常染色体隐性遗传(Autosomal recessive, AR)[1～3]。该病临床特征主要表现为不同程度的骨折、骨畸形、骨脆性增加、蓝巩膜、牙本质发育不全、听力下降等[4,5]。据统计，成骨不全在国外的发病率为 1/30000～1/10000[4]，而在中国人群中的发病率约为4/10000[5]。根据最新文献报道，成骨不全可分为Ⅰ～ⅩⅤ型(表1)。其中，成骨不全Ⅰ型(OI-Ⅰ, MIM 166200)最为常见，但症状相对较轻，主要表现为轻度的身材矮小，轻度到中度的骨裂，骨质疏松，骨密度下降，易反复骨折而引起多处畸形，关节松弛以及蓝巩膜等。OI-Ⅰ为 AD遗传，表现度有差异，有的表现为反复骨折，有的仅表现为骨裂，群体发病率约 1/3万活婴。本病是由Ⅰ型胶原蛋白基因突变所致，Ⅰ型胶原是由2条α1链和1条α2链组成，分别由COL1A1基因和COL1A2基因编码，其中COL1A1基因位于染色体17q21.31～q22.05，全长18 kb，有51个外显子，COL1A2基因位于染色体7q22.1，全长38 kb，有52个外显子[6]。

成骨不全至今仍无切实有效的根治手段，因此，检出突变、对新突变进行鉴定、阐明病因、对再次妊娠的高危胎儿实施产前基因诊断是目前防治该病的最佳应对策略和优生手段，而阐明其分子遗传学发生机制也是开展孕早期诊断和胚胎植入前诊断的必要前提条件。

本研究对一疑似成骨不全Ⅰ型的家系进行了COL1A1、COL1A2基因诊断，发现COL1A2基因存在一新的错义突变，并对该新突变进行了详细的致病性鉴定。

表1 成骨不全分型列表

1 对象与方法

1.1 研究对象

先证者：女，汉族，就诊时9岁7个月，2014 年4月因骨骼畸形及大腿骨折复发，经外院转诊到我室进行基因诊断，以便为其父母再孕时的产前基因诊断做准备。据述，患儿从小就有反复骨折病史，1岁7个月时就因外伤发生过骨折。2岁1个月时复诊：右下肢不愿活动，动之哭闹加剧，拍片示右股骨下段青枝骨折。2岁11个月复诊：右股骨骨干细小，向外弯曲畸形，见多个新旧之骨折，对位尚好，右膝诸骨骨质疏松。诊断意见：上述骨质改变考虑成骨不全。4岁11个月因右下肢弯曲短缩畸形、跛行2年多入院检查。X光片显示：右侧股骨弯曲畸形为成骨不全改变，原病理骨折已愈合。膝关节及胫骨骨骺骨质疏松。诊断：成骨不全症；右股骨陈旧性骨折并弯曲畸形。5岁 8个月因右大腿弯曲畸形，术后9个月复查，结论同4岁11个月。7岁1个月入院检查，X光片所见：左股骨中段骨折，骨痂较前增多，较明显。成骨不全改变，同前。左股骨下端外侧干骺端密度增高硬化。8岁2个月因“跌倒致伤左大腿肿痛活动受限1 d”入院检查，大腿中上段中度肿胀，压痛敏锐，纵叩痛(+)，骨干力丧失，扪及骨擦感及异常活动，膝关节活动受限，足背动脉搏动可触及，趾动，血运好。诊断：左股骨上段骨折；成骨不全。

先证者父亲：小时未发生骨折，但在12～13岁时，因骑车摔倒等外伤曾发生过多次骨裂，骨裂部位发生在双手的前臂，也发生在双下肢的小腿，但症状较轻，发病年龄也比其女儿晚。根据上述临床资料，拟诊为成骨不全Ⅰ型，详细病因及分型待基因检测确诊。

正常对照组：为我室近3年来收集的、来自南方地区的、无亲缘关系的、表型正常的健康个体共150名。其中男80名，年龄24～32岁；女70名，年龄22～28岁。另外，还收集了先证者家族中表型正常的部分亲属共6人，其中男、女各3人。

本研究已得到中山大学中山医学院伦理委员会批准，患儿及其父母完全知情并签署“基因诊断知情同意书”。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA模板的制备

抽取先证患儿、患儿父母及正常对照组的外周血各2～4 mL(1～2管)，EDTA抗凝。参考文献[7]的方法或全血DNA提取试剂盒(Sigma公司)制备模板DNA，4℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增及测序

普通引物的扩增：参照文献[8,9]设计 COL1A1 和COL1A2基因的扩增引物，引物由上海美吉公司或北京中美泰和公司合成。COL1A1基因扩增条件参照文献[10,11]。COL1A2基因扩增条件：94℃预变性3 min；94℃变性30s，55～65℃复性40 s，72℃延伸45s，38个循环；最后再72℃延伸10 min，4℃保存或直接电泳。扩增体系(30 µL)：10×Buffer 3 µL，10 mmol/L dNTP Mix 2.8 µL，上、下游引物各1 µL，模板2 µL，ddH2O 20 µL，rTaq 酶0.2 µL(试剂盒购自TaKaRa公司)。

为了保证建筑物平面尺寸和各层标高的正确，砌筑前应认真做好抄平、放线工作，砌砖时必须跟线走。铺灰不能半边厚、半边薄，以免造成砖面倾斜，砌筑时应做到“三层一吊，五层一靠”。

COL1A2基因E19(c.946)特异引物的扩增：根据等位基因特异性扩增(Allele-specific amplification, ASA)，即扩增阻碍突变系统(Amplification refractory mutation system, ARMS)原理，针对新突变位点c.946G> T，采用Primer premier 5.0软件，设计一对单碱基错配特异引物。上游引物：5′- CCGCCGGTCCCCGTGGTGAAG-3′，下游引物：5′-GCCGGGAGCCCCAGCAACGCA-3′。扩增条件：94℃预变性3 min；94℃变性30s，68℃复性40 s，72℃延伸40s，30个循环；最后再72℃延伸10 min。扩增体系(20 µL)：2×Taq PCR StarMix 10 µL，ddH2O 7 µL，上、下游引物各1 µL，模板1 µL(试剂盒购自北京康润生物公司)。用 1.2%～1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。为了验证错配的碱基是否与设计的一致，PCR扩增后将产物送测序公司进行测序。普通引物和特异引物的扩增产物，根据需要进行正向或反向或双向测序。

1.2.3 新突变的致病性鉴定

对 HGMD数据库(The Human Gene Mutation Database, 2014, http://www.hgmd.org/)、NCBI dbSNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)和近5年的文献进行检索，证实先证患儿所携带的COL1A2基因c.946G>T/p.G316C突变是一新的突变类型，故需对其致病性进行详细鉴定，以阐明患儿发病的真正内因。鉴定步骤包括：(1)采用DHPLC(Denaturing high performance liquid chromatography)法对由患儿和其父组成的实验组以及由其母和 150名健康人组成的正常对照组进行突变筛查，以统计该突变在群体中的发生频率，从而确认或排除多态性的可能；(2)采用 ASA(Allele specific amplification)法直接将实验组和对照组样品同时扩增，通过观察扩增结果，来鉴定待检样品是否存在突变，然后统计、确认或排除多态性的可能；(3)利用Clustal X软件，对人(Homo sapiens)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、牛(Bos taurus)、黑猩猩(Pan troglodytes)、猕猴(Macaca mulatta)、原鸡(Gallus gallus)、非洲爪蟾(Xenopus)、斑马鱼(Danio rerio)、叶吻银鲛(Callorhinchus milii)等13个物种该位点的氨基酸进行保守性分析，根据保守性的强弱来判断突变致病性的大小；(4)利用SIFT和PolyPhen软件对突变的危害性进行预测，以此判断该突变的致病性。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增及测序

利用COL1A2基因E19普通引物对正常对照、患儿父亲、患儿母亲、先证患儿进行PCR扩增，结果显示：4个样品均有372 bp的扩增产物(图略)，这与预期结果完全相符。

测序结果表明，患儿COL1A1基因51个外显子均未检出病理性突变，但在COL1A2基因第19外显子的编码区内却发现一杂合错义新突变(c.946G>T)，为G/T杂合峰形(图1D)。将患儿父母和正常对照的E19同时测序，然后用 Chromas软件进行比对，发现患儿突变来自其父(图1B)，而其母正常(图1C)。

图 1 正常对照(N)、患儿父亲(F)、患儿母亲(M)、先证患儿(P)的COL1A2 E19正向序列比对图

2.2 新突变的致病性鉴定结果

2.2.1 COL1A2 E19的DHPLC筛检结果

图2 COL1A2 E19的DHPLC筛检结果

2.2.2 COL1A2 E19 的ASA筛检结果

COL1A2 E19特异引物的扩增产物为391 bp。患儿父亲与患儿均扩增阳性(图3的泳道2和4)，而母亲为阴性(图3的泳道3)，2例正常对照也全为阴性(图3的泳道1和5)。另外，随机选取的148例正常对照扩增也均为阴性。这与本文预期的结果完全一致，说明正常组不含有c.946G>T突变，从而说明该突变不是一般的多态性变异，而是一种新的致病性突变。

图3 COL1A2 E19特异引物的扩增产物

2.2.3 COL1A2 E19单错配特异引物的验证结果

突变点的碱基与本文设计时引入的单错配碱基(把正常的 G错配为 T)完全一致，进一步验证了产物的准确性、鉴定的可行性(图4，C和D)。正常的纯合G由于无法与错配碱基T配对，故扩增阴性，而杂合子既含有 G，也含有 T，所以有一条模板链扩增阳性，故有扩增产物。C和D分别是患儿父亲和先证患儿，其c.946均为T纯合子(三划线所示)。

图4 COL1A2 E19普通引物和特异引物扩增产物的测序比较结果

2.2.4 突变位点氨基酸的保守性分析结果

COL1A2肽链即α2链第316位氨基酸即新突变所在位置，在13个不同来源的跨物种中均为甘氨酸(G)(图5红框所示部位)，说明该位点在进化过程中高度保守，也说明这个氨基酸具有重要的生化功能。因此，该位点一旦发生突变，势必影响Ⅰ型胶原α2链的氨基酸组成，影响其螺旋结构，进而影响其正常功能，最终导致OI-Ⅰ型的发生。由此可以推断，这个新突变很可能就是致病性突变。

2.2.5 SIFT和PolyPhen-2软件对突变危害性的预测结果

SIFT软件预测结果为“有害的”，如图 6蓝框所示部位。PolyPhen-2预测结果为“很可能有害”(图略)。可见p.316位的甘氨酸被半胱氨酸替代是有害的，因而进一步证实p.G316C突变是一种新的致病性突变。

图5 p316甘氨酸(G)在13个跨物种中的保守性分析结果

图6 SIFT软件预测结果

3 讨 论

成骨不全(OI)类型多，症状大多相似，临床诊断只能初诊而无法确诊和分型，更无法在孕早期进行产前诊断。而基因诊断不但可以确诊，而且可以用于产前/植入前诊断。OI-Ⅰ型是由于COL1A1基因或COL1A2基因发生突变所致，所以找到病理性突变是确诊的关键。本文通过对先证者的 COL1A1、COL1A2基因进行详细的检测，COL1A1基因未发现任何病理性突变，但在COL1A2 E19的编码区内首次发现一个杂合错义突变(p.G316C)。这两个基因都具有高度遗传异质性，不但种类多(截至本文发稿之时已报近千种，其中，COL1A1基因的突变种类有614种，COL1A2的有357种(http://www.hgmd.cf.ac. uk/ac/index.php))，而且突变类型也多种多样。不同的突变类型，其表型效应也不同，甚至大相径庭。对于单碱基置换引起的错义突变，情况更为复杂，病因更难确定。因此，对于新发现的未知突变，必须对其致病性进行详细鉴定，方能阐明发病的真正原因，才能为今后的产前乃至植入前诊断创造前提条件。本文先证患儿的父母7、8年来一直不敢再孕就是因为基因水平的病因一直未明的缘故。

对于新突变的致病性鉴定，目前比较常用、比较可行的方法主要有：突变频率的统计；突变点氨基酸的保守性分析；生物信息学软件对突变危害性的预测；正常蛋白与突变蛋白高级结构的比对。此外，还可进行RNA水平、蛋白水平的鉴定，如果是遗传性代谢病，还可进行酶学鉴定。对于群体突变频率的统计，主要是用于排除SNP的可能。虽然统计方法不少，但由于样品量大、费用高，故需采用快速特异、简便廉价、高通量的技术。DHPLC、ASA法正好可以满足这些条件，它们可以在短短几天之内完成对数百例样品的筛检，既快速特异，又容易操作，而且成本也较低。

关于RNA水平、蛋白水平的鉴定，由于COL1A1、COL1A2基因都不在外周血表达或表达极少，而主要在皮肤、骨髓、脂肪细胞、PB-CD4+T细胞、胸腺、扁桃腺、脑、睾丸、卵巢、肝、肾、肺、心脏、胰岛等组织表达(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgNear? org=human)，而取皮肤、骨髓等组织均为有创性检查，加上OI病会导致患儿血小板明显减少，故很难征得患儿父母的同意，所以很难在RNA水平和蛋白水平进行更深入地鉴定。

关于COL1A1、COL1A2基因突变的分子致病机制目前主要有两种：一是杂合无义突变、移码突变和剪切位点改变导致了COL1A1基因单倍剂量不足，它是引起OI-Ⅰ型的主要致病机理。因为这些突变会导致mRNA的不稳定，导致约50%的Ⅰ型胶原的合成减少[12]；二是COL1A1、COL1A2基因突变引起甘氨酸的替代，导致 α链不能正确合成，导致Ⅰ型胶原分子的结构异常，从而影响到整个胶原纤维网络，最终引起疾病的发生。而表型的多样性可能与Ⅰ型胶原螺旋结构的破坏程度和聚集位点在蛋白质相互作用的重要性有关[12]，因为Ⅰ型胶原的三胶螺旋区都含有338个连续重复的Gly-X-Y三螺旋结构，甘氨酸的存在对三螺旋的形成至关重要[13]。

COL1A1和 COL1A2基因突变导致的甘氨酸替换会引起Ⅰ型胶原三级螺旋结构的不稳定[12]，发生在Ⅰ型胶原α1链上的甘氨酸的替换通常是致死的，而由COL1A2基因突变引起的甘氨酸的替换则通常是不致死的[14]。本文所发现的新突变(c.946G>T, p.G316C)，导致了α2链上甘氨酸(G)被半胱氨酸(C)替代，其临床症状较轻也印证了这一点。Gentile等[15]报道，COL1A2基因c.946G>A突变(p.G316S，“甘氨酸”被“丝氨酸”替代)会引起 OI-Ⅰ型(临床症状仅表现为轻度畸形或无畸形)；Marini等[14]报道，COL1A2基因c.946G>C突变(p.G316R，“甘氨酸”被“精氨酸”替代)则引起OI-Ⅲ型(临床表现为骨骼严重畸形)，可见相同位点被不同氨基酸替代有可能产生不同的表型，而相同氨基酸在同一位置替换在不同的个体中也会有不同的表型，本文中先证患女的症状较其父亲严重也印证了这一点。G316S和G316R错义突变之所以会出现表型的明显差异，很可能是因为丝氨酸S的化学结构、所带电荷数和等电点(Ser 的pI=5.68)跟甘氨酸G的差别不大(Gly的pI=5.97)，故对第 316位氨基酸所形成的立体空间构象影响不大，故只表现为较轻的Ⅰ型；而精氨酸R正好相反，它是一种碱性氨基酸，其化学结构、官能团、所带电荷数和等电点(Arg的pI=10.76)等都跟甘氨酸有明显差别，故突变后会造成第316位氨基酸所形成的空间构象发生明显改变，进而影响到胶原蛋白α2链的正常结构和功能以及与α1链的相互结合，导致Ⅰ型胶原蛋白合成受阻，继而导致成骨组织合成出现明显障碍，最终导致OI-Ⅲ型的发生。本文所发现的半胱氨酸，其化学性质和丝氨酸很相似，都是极性中性氨基酸，其化学结构、所带电荷数和等电点(Cys 的 pI=5.05)和甘氨酸的差别也不大，所以也只产生Ⅰ型表型(从本文所研究的对象来看，p.G316C新突变所导致的表型效应符合OI-Ⅰ型的临床表现)。

由于OI-Ⅰ型临床症状较轻，故在临床上容易出现误诊和漏诊，此时基因诊断对该病的确诊至关重要。本研究一方面揭示了患儿发病的分子遗传学机制，另一方面进一步丰富了 HGMD突变数据库的COL1A2基因突变类型，更重要的是为患儿父母今后的早期产前诊断乃至胚胎植入前基因诊断创造了必要的前提条件。

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(责任编委: 谢小冬)

Genetic screening of a pedigree with osteogenesis imperfecta type Ⅰand identification of a novel mutation in COL1A2 pathogenic gene

Rong Li1, Yuanping Guo2, Jingxin Pan3, Yibin Guo1
1. Department of Medical Genetics, Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China; 2. Amateur Team, Department of Medical Genetics, Sun Yat-sen University/ Class 3, Senior 2, The 16th Middle School, Guangzhou 510080, China; 3. Department of Internal Medicine, The Second Affiliated Hospital, Fujian University of Medical Science, Quanzhou 362000, China

To uncover the molecular pathogenic mechanism of congenital osteogenesis imperfecta (OI) type I, all the 103 exons of the COL1A1 (Collagen, type Ⅰ, alpha 1) and COL1A2 (Collagen, type Ⅰ, alpha 2) genes in a child with OI type Ⅰ were screened using PCR-DNA direct sequencing. The results showed no pathological mutation in COL1A1gene, but a novel mutation c.946G>T/p.G316C in the exon 19 of COL1A2 gene, which was inherited from her father. This mutation was not found in her mother and other six phenotypically normal relatives. By denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) screening, the abnormal double-peak was visualized in PCR products of exon 19 of COL1A2 gene in the proband and her father, while the normal single-peak was shown in those of her mother and all the healthy controls. Using allele specific amplification (ASA) screening, a specific band of 391 bp in COL1A2 exon 19 was amplified only in the proband and her father, but not in other samples. The amino acid encoded by the mutation site is evolutionarily highly conserved, and this mutation was a “damaging” or “probably damaging” factor to OI type Ⅰ, based on the predicting results using SIFT and Polyphen-2 softwares. In conclusion, the novel c.946G>T/p.G316C mutation in COL1A2 gene is a pathogenic mutation that could result in OI type Ⅰ. If the couple wants to get pregnant again, it is necessary to screen the mutation site in COL1A2 gene through the prenatal genetic diagnosis in the first trimester or through preimplantation genetic diagnosis (PGD) in the progestation.

osteogenesis imperfecta type Ⅰ; C0L1A2 gene; novel mutation; pathogenic identification

2014-07-10;

2014-09-28

国家自然科学基金项目(编号：30772069)和闽粤横向科研基金项目(编号：71010025)资助

李荣，硕士研究生，专业方向：医学遗传学。E-mail: banshou913@126.com

郭奕斌，副教授，硕士生导师，研究方向：遗传病的分子诊断及产前/植入前基因诊断。E-mail: aguoabin@qq.com

10.16288/j.yczz.2015.01.006

时间： 2014-11-24 17:57:46

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20141124.1757.003.html