亚洲棉全基因组中NAC类转录因子基因的鉴定与分析

赵灿，刘任重，柳展基，李菲，王立国，马骏骏，朱新霞

（1石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室，石河子 832003；2山东棉花研究中心，济南 250100）

NAC转录因子是广泛存在于植物中的一类转录因子。1996年 Souer等[1]在矮牵牛(Pharbifis nilL.)中克隆了第一个NAC转录因子基因NAM(no apical meristem)，其nam突变株不能形成顶端分生组织，大部分突变体在幼苗期便死亡，少数存活突变体的花器官发育异常。1997年Aida等[2]首先报道了NAC结构域，发现 NAM、ATAF1/2和 CUC2(cup-shaped cotyleton)基因编码蛋白的N末端有一段大约150个氨基酸的保守结构域，取此3个基因首字母命名为NAC。NAC蛋白N末端氨基酸序列相对保守，主要功能为结合DNA序列、细胞核定位及与其它NAC蛋白形成二聚体等，而C末端氨基酸序列高度变异，行使转录激活或转录抑制功能[3]。

NAC转录因子在植物生长发育、代谢调节、器官形成、激素响应等方面发挥重要作用。Mao等[4]在水稻(Oryza sativaL.)中过量表达OsNAC2基因，发现转基因水稻株高降低、分蘖能力增强且分蘖角度增大。Xie等[5]发现拟南芥(Arabidopsis thalianaL.)的NAC1基因受生长素诱导表达，通过激活2个下游生长素响应基因DBP和AIR3来促进侧根发育。Uauy等[6]研究发现普通小麦(Triticum aestivumL.)NAC转录因子NAM-B1基因能够加速植株衰老，促进叶片中的营养物质向发育中的籽粒转运，进而提高籽粒中的蛋白质、锌和铁的含量。Zhong等[7]发现拟南芥中NAC转录因子SND1为调控纤维次生壁合成的主要转录开关，在茎维管束纤维和木质部纤维特异表达，抑制或过表达SND1会导致纤维次生壁的缺失或加厚。在生物和非生物逆境响应方面，不同物种的NAC转录因子同样发挥重要作用[8-9]。

在拟南芥、水稻和雷蒙德氏棉(Gossypium raimondiiL.)等测序完成的基因组序列中，利用生物信息学方法已成功预测了大量NAC转录因子基因[11]，其中拟南芥有117个、水稻基因组中有151个成员、烟草 (Nicotiana tabacumL.)152个、大豆(Glycine maxL.)152个、雷蒙德氏棉145个，为进一步研究相应物种的NAC转录因子的功能奠定了基础[11]。在雷蒙德氏棉NAC转录因子基因家族的分析中，Shang等[10]将145个NAC-TF基因划分为18个不同的亚家族，其中127个基因分布于13条染色体上，80(55%)个基因含2次重复，6个基因含3次重复。基因表达分析发现大部分NAC-TF基因呈时空和组织特异性表达模式。亚洲棉(Gossypium arboretumL.)被认为是最接近陆地棉A染色体组的供体，其基因组测序已经完成，相关结果发表在2014年5月18日出版的《Nature Genetics》上[12]。本研究利用生物信息学方法对亚洲棉全基因组的NAC基因成员、染色体定位、基因结构和系统进化等进行了分析，以期为进一步进行亚洲棉及陆地棉NAC转录因子基因的克隆和功能分析奠定基础。

1 材料与方法

1.1 亚洲棉NAC基因的鉴定

亚洲棉的基因组序列下载于中国农业科学院棉花研究所网站(http：//cgp.genomics.org.cn/page/species/in dex)。将亚洲棉蛋白质序列构建至本地BLAST数据库，以Pfam数据库(http：//pfam.xfam.org)中NAM结构域(PF02365)为探针进行BLASTP搜索(E≤ 10-5)。匹配的NAC候选序列经Clustal软件比对后，去除冗余序列，同时去除NAM结构编码氨基酸数目低于120的候选序列。根据亚洲棉NAC基因在染色体上的位置和分布，利用MapChart2.2绘制物理图谱。利用Pfam数据库分析NAC蛋白的保守结构域，存在NAM结构域的蛋白序列属于NAC蛋白家族。基因结构利用在线软件 Gene Structure Display Server(GSDS，http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)分析获得[13]。

1.2 亚洲棉NAC基因系统进化树的构建

利用Clustal对亚洲棉和部分功能已知的拟南芥、矮牵牛、小麦、水稻等的NAC蛋白序列进行氨基酸序列多重比对后，利用MEGA 6.0软件采用邻接法(neighbor joining，NJ)构建系统进化树，对构建的进化树进行自检，校验参数bootstrap值重复设为1000。拟南芥NAC蛋白序列来自于拟南芥数据库(http：//www.arabidopsis.org)。其它物种的NAC蛋白序列下载自NCBI数据库。

2 结果与分析

2.1 亚洲棉NAC基因的鉴定

利用保守的NAM结构域检索亚洲棉基因的蛋白质序列，共发现138个匹配序列，经Pfam数据库分析，均含有保守的NAM结构域(PF02365)。根据其所在染色体位置及先后顺序进行了系统编号，命名为GaNAC001-GaNAC138。GaNAC基因在亚洲棉13条染色体上皆有分布，但数目不均，其中第2号染色体最少，仅1个，即GaNAC010，而第11号染色体最多，共有16个(图1)。有9条染色体上的GaNAC基因在10个以上。多数NAC基因在染色体上的位置分布较为均匀，但在 3、4、5、7、10、11和 13号染色体上均存在多个NAC基因紧密邻接的基因簇，其中 2重复基因 GaNAC014和 GaNAC015、GaNAC034和 GaNAC035、GaNAC092和 GaNAC093、GaNAC101和GaNAC102、GaNAC133和 GaNAC134相隔基本均在10 kb以内。在其它未进行染色体定位的18个scaffolds上均未检索到NAC基因。GaNAC基因的长度差异较大，平均长度为1957 bp，其中GaNAC099最长，为 7936 bp；GaNAC068最短，为 544 bp。GaNAC基因编码蛋白的长度为78-859个氨基酸，平均长度为326个氨基酸。

图1 GaNAC基因家族在亚洲棉染色体上的位置和分布（基因图距单位为Mb）Fig.1 The location and distribution of GaNAC gene family in Gossypium arboretum chromosomes（The gene map distance unit is Mb）

2.2 亚洲棉GaNAC基因结构的分析

分别下载138GaNAC基因的蛋白序列和DNA序列，利用在线软件GSDS对其基因结构进行了分析。如图2A所示，不同的GaNAC基因结构差异较大，分别含有0-8个内含子，其中GaNAC029没有内含子；9个GaNAC基因仅含1个内含子，占6.5%；88个GaNAC基因含有 2个内含子，占 62.4%；12个GaNAC基因含有3个内含子，占8.6%；其余28个GaNAC基因含有4-8个内含子，占20.2%。另外，内含子的长度差异也较大，最短的内含子长度仅为4 bp，为GaNAC084基因的第1个内含子；最长的内含子长度为4802 bp，为GaNAC097基因的第1个内含子。此外，还有15个GaNAC基因含有长度超过1500 bp的内含子。

138个GaNAC蛋白均含有NAM结构域，其中137个GaNAC的NAM结构域在N末端前150个氨基酸之内，仅有GaNAC059的NAM结构域位于N末端前150个氨基酸之后 (图 2B)。另外，GaNAC037、GaNAC085和GaNAC134、GaNAC095还各含有1个非特异识别 (Non-specific hit)的结构域，分别为DUF2756超家族、marB、Tox_ODYAM1。GaNAC097除含有NAM结构域外，还含有1个特异识别(Specific hit)的PA_subtilisin_lik(枯草杆菌蛋白酶)结构域(E值：9.95E-11)。

图2 138个亚洲棉NAC转录因子的基因结构及NAM结构域Fig.2 Gene structure and NAM domain of 138 GaNAC gene family

2.3 亚洲棉GaNAC蛋白的系统进化分析

在模式植物拟南芥和水稻中，部分NAC转录因子的功能已经明确，我们从中挑选了14个参与植物生长发育调控、激素信号转导、生物及非生物胁迫响应等功能已知的NAC蛋白，利用ClustalW软件对其与亚洲棉GaNAC蛋白序列进行多重比对，构建系统进化树。根据氨基酸序列的相似程度及其进化关系，将亚洲棉GaNAC蛋白分为11个亚家族(图3)。不同亚家族中的GaNAC蛋白数目差异很大，为4-25个。在第Ⅰ亚家族包含19个GaNAC蛋白，其中GaNAC022、GaNAC040、GaNAC043、GaNAC108、GaNAC 026、GaNAC068和 GaNAC053与拟南芥 SND1、NST1和NST2关系最近，SND1、NST1和NST2在调控次生壁合成中起重要作用[14]，暗示这7个GaNAC转录因子的功能可能与次生细胞壁合成有关。第Ⅱ亚家族包含17个GaNAC蛋白，GaNAC023、GaNAC066、GaNAC124、GaNAC055和 GaNAC104等与拟南芥AtNAC1、CUC1/2、NAM共聚在一起 ，AtNAC1、CUC1/2、NAM与顶端分生组织形成有关，表明该亚家族成员可能与组织形成有关。第9染色体上的基因GaNAC084与第1染色体上的基因GaNAC005及GaNAC008旁系同源，两两之间蛋白质一致性高达74.8%以上。第Ⅲ亚家族仅包含4个GaNAC蛋白。第Ⅳ亚家族包含20个GaNAC蛋白，与NTL8聚在一起。在拟南芥种子萌发过程中，高盐可以通过赤霉素信号途径诱导NTL8的表达[15]。位于第11染色体上的基因GaNAC101和GaNAC102，外显子和内含子均不同，但含有完全相同的NAM结构域，编码的蛋白质一致性高达99.5%，可能在信号转导中有相同的功能。第Ⅴ亚家族由23个亚洲棉GaNAC蛋白组成，为亚洲棉最大的亚家族，其中位于第5染色体上的3个基因GaNAC033、GaNAC034和GaNAC035紧密相连，两两相隔约在8 kb以内，氨基酸序列一致性达83%以上，结构和功能相近 (图1-图3)，明显是基因倍增的结果，为旁系同源基因。第Ⅵ亚家族包含11个GaNAC蛋白，其中GaNAC136和GaNAC137、GaNAC074和GaNAC105可能为旁系同源基因对，蛋白一致性分别为70.1%和80.5%，该家族蛋白与ATAF1/2、OsNAC6和RD26等生物和非生物胁迫响应转录因子聚在一起，表明这些GaNAC基因可能在逆境应答和防御中起作用。第Ⅶ亚家族包含19个GaNAC蛋白，与NAM-B1、AtNAC2聚在一起，NAM-B1能加速小麦植株衰老[6]，AtNAC2与拟南芥的衰老有关[16]，故推测该亚家族GaNAC蛋白可能参与植株衰老过程。第Ⅷ至Ⅺ亚家族各包含4、5、4、7个GaNAC蛋白。第8染色体上的2个基因对GaNAC077和 GaNAC078、GaNAC071和 GaNAC072为旁系同源基因对，蛋白质一致性分别为82.0%、92.9%，分别位于Ⅴ、Ⅶ亚家族，而位于第12染色体上的GaNAC115又与GaNAC071和 GaNAC072旁系同源，蛋白质一致性在81%以上。第9染色体上的基因GaNAC085与第13染色体上的基因GaNAC134及 GaNAC133旁系同源，两两之间蛋白质一致性高达92.1%以上，位于第Ⅹ亚家族。

图3 GaNAC蛋白的系统进化分析Fig.3 Polygenetic tree analysis of GaNAC protein family

2.4 亚洲棉与陆地棉、雷蒙德氏棉NAC蛋白的同源性分析

利用138个亚洲棉NAC蛋白序列分别与145个雷蒙德氏棉[10]、78个已克隆的陆地棉[17-20]以及105个拟南芥的NAC蛋白氨基酸序列进行同源性分析。亚洲棉与雷蒙德氏棉NAC蛋白匹配程度最高，平均序列一致性达93.9%，其次为陆地棉，平均序列一致性达81.2%，拟南芥最低，平均一致性为54.9%。有58个直系同源基因的蛋白质序列在亚洲棉、雷蒙德氏棉和陆地棉之间一致性达到95%以上，E值多数为0，如 GaNAC031、GRNAC081和 GhNAC43蛋白序列一致性达100%，说明这些基因在棉属的进化过程中高度保守，对维持棉属的生命功能至关重要；有41个NAC基因在亚洲棉和雷蒙德氏棉之间高度保守，蛋白一致性在95%以上，但和陆地棉之间差异较大，有2个NAC基因在亚洲棉和陆地棉之间高度保守，但和雷蒙德氏棉之间差异相对较大，另有37个NAC基因在亚洲棉、雷蒙德氏棉和陆地棉之间差异均较大，说明这些基因在进化过程中变异程度较高，有些可能是生物体为了适应环境的变化产生了新的功能。

3 讨论

自2000年底拟南芥基因组序列发布以来，植物基因组研究发展很快，截止目前，已有70多个植物基因组测序完成，其中包括二倍体棉花亚洲棉(AA)和雷蒙德氏棉(DD)。基因组测序产生的大量数据为研究基因结构、可变剪切、物种进化和基因家族预测等提供了机会。本研究利用生物信息学方法在亚洲棉基因组中鉴定出了138个GaNAC基因，分布于亚洲棉13条染色体上，并结合部分功能已知的NAC蛋白构建了系统进化分析，为进一步研究GaNAC基因的功能奠定了基础。

（1）根据雷蒙德氏棉、可可(T.cacaoL.)、拟南芥和水稻共473个NAC蛋白序列的N末端NAM结构域的比对结果，Shang等[10]将NAC基因划分为18个亚家族。进一步根据145个雷蒙德氏棉NAC蛋白的多重比对结果，将雷蒙德氏棉NAC基因划分为13个亚家族[10]。在本研究中，我们结合拟南芥、水稻、矮牵牛和小麦中14个功能已知的NAC蛋白序列，将138个亚洲棉GaNAC基因划分为11个亚家族，与上述结果基本一致。一些结构和功能相近，且在染色体上位置紧密相邻的NAC基因，明显是基因倍增的结果，有的为2重复，有的为3重复，这些旁系同源基因体现出亚洲棉基因组中NAC基因的冗余现象。通过与陆地棉、雷蒙德氏棉NAC蛋白的同源性分析，发现一些直系同源的NAC基因在这些种间高度保守，另一些则变异性相对较大，体现出在棉属进化过程中的不同特性。NAC基因在同一棉种或不同棉种中的数目、结构或功能的变化，是由于棉属基因组在进化过程中经历的多轮染色体复制、重排或二倍体化造成的[21]。A、D基因组棉种于600万-730万年前开始分化[22]，大约在130万-170万年前A基因组植株被D基因组植株授粉，形成异源四倍体的AD基因组棉种[22]。相对于其它物种，棉属的不同种间基因组同线性和共线性较强，基因组结构在进化上比较保守[23]，本研究中发现亚洲棉与雷蒙德氏棉、陆地棉NAC蛋白序列同源性及一致性极高，进一步证实了这种观点。而相对于雷蒙德氏棉，亚洲棉与陆地棉NAC蛋白序列差异较大，可能由于分析中仅采用了陆地棉中的部分NAC蛋白序列，一些更加匹配的陆地棉NAC蛋白序列被排除在外。待陆地棉和海岛棉AD基因组测序结果发表后再进行分析，将会得到更加准确的信息。

（2）截止目前，陆地棉中已经克隆了近78个GhNAC基因[17-20]，表达分析发现它们可能在叶片衰老、纤维发育、生物和非生物逆境等方面起作用。我们利用BlastP软件对GaNAC和GhNAC蛋白进行了分析，每一个GaNAC蛋白只选取最佳匹配的GhNAC蛋白，结果发现32个GaNAC蛋白与21个GhNAC匹配。叶片衰老通常被认为是基因和环境共同控制的结果[24]。拟南芥NAC类转录因子中超过1/5的基因(20/106)与叶片衰老有关[24]。Shah等[18]在陆地棉中发现了15个叶片衰老相关的GhNAC转录因子，本研究中22个GaNAC基因与其序列相似性较高，如GaNAC078与GhNAC18间的序列一致性高达99.5%，占亚洲棉总GaNAC的15.60%，与拟南芥中结果相似[24]，这些基因为研究棉花的熟性机制及抗早衰机理研究提供了可能。

（3）棉花纤维发育经历了起始期、伸长期(初生壁形成)、次生壁形成和成熟期。Shah等[18]分析了GhNAC基因在陆地棉纤维发育过程中的表达变化，发现GhNAC31、GhNAC49、GhNAC73和GhNAC77在10DPA(days post anthesis)表达量最高，GhNAC53、GhNAC71、GhNAC72在15 DPA时表达量达到高峰，表达这些基因与棉花纤维发育早期伸长(7-20 DPA)有关，而GhNAC25和GhNAC27在25DPA时表达量最强，此时恰逢纤维次生壁合成开始。本研究共发现10个GaNAC基因与陆地棉纤维发育相关GhNAC基因匹配，因此推测它们可能在棉花纤维发育中起作用。

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