FKN、PI3K及NF-κB对人外周血单个核细胞IL-6表达的的影响及缬沙坦的干预作用

（中国医科大学附属第四医院心血管内科，沈阳 110032）

FKN、PI3K及NF-κB对人外周血单个核细胞IL-6表达的的影响及缬沙坦的干预作用

于霏，金元哲，雷明明，张学颖，张晓春，刘君

（中国医科大学附属第四医院心血管内科，沈阳 110032）

目的探讨不规则趋化因子Fractalkine（FKN）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、核因子κB（NF-κB）对外周血单个核细胞（PBMC）IL-6表达的影响及缬沙坦的干预作用，研究FKN影响IL-6表达的信号转导机制。方法利用密度梯度离心法分离健康人外周血单个核细胞，将提取的PBMC分为7组：空白对照组、FKN组、LY294002组（PI3K抑制剂）、PDTC组（NF-κB抑制剂）、FKN+缬沙坦组、FKN+LY294002组、FKN+PDTC组，后二组在FKN诱导PBMC细胞前分别由LY294002、PDTC预处理。各组PBMC分别在12 h和24 h后，用酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测各组细胞培养液中的IL-6表达。结果培养12 h后，与对照组比较，FKN组IL-6明显降低（P＜0.05），LY294002组和PDTC组无明显差异（P＞0.05）；与FKN组比较，FKN+缬沙坦组IL-6明显降低（P＜0.05），FKN+LY294002组IL-6明显升高（P＜0.05）、FKN+PDTC组IL-6明显降低（P＜0.05）。培养24 h后，各组IL-6表达无明显差异（P＞0.05）。结论FKN对人外周血单个核细胞IL-6的表达具有双向调节作用，通过PI3K途径抑制IL-6的表达，而通过NF-κB途径促进IL-6的表达，总体上FKN可以抑制IL-6的表达。缬沙坦可增加FKN抑制IL-6表达的作用。

不规则趋化因子；磷脂酰肌醇-3激酶；核因子κB；IL-6；缬沙坦

Fractalkine（FKN）是最近新发现的一种趋化因子，存在于多种正常组织器官如心脏、脑、肾和肺，由活化内皮细胞表达，分泌型FKN可与受体CX3CR1结合，增强自然杀伤细胞（NK）的杀伤力，导致血管内皮细胞损伤［1］，同时介导白细胞黏附、趋化。关于FKN和IL-6之间的关系，目前国内外鲜有报道。因此本文针对FKN如何影响IL-6表达进行深入研究，同时研究该过程缬沙坦的药物作用，以及探讨PI3K和NF-κB在IL-6表达过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人外周血浓缩白细胞、优等胎牛血清（FBS）（Hyclone公司）、青霉素及链霉素（华北制药厂）、淋巴细胞分离液（浓度1.077 g/mL）（天津，TBD公司）、乙二胺四乙酸（EDTA，Promega公司）、人IL-6 ELISA检测试剂盒（武汉，USCN.Life Science Inc）、重组人Fractalkine（Sigma公司）、LY294002（Sigma公司）、PDTC（Sigma公司）、缬沙坦（Sigma公司）、RPMI1640培养基（Gibco公司），DMSO（Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 人外周血单个核细胞（PBMC）的分离及分组：无菌条件下，先用密度梯度离心法从人外周血浓缩白细胞中分离PBMC，然后将1×106个单个核细胞（0.2 mL）孔铺于96孔细胞培养板中，将细胞随机分为7组，每组2个复孔。对照组将PBMC置于37℃，5%CO2培养箱中孵育。FKN组在PBMC培养液中加FKN，终浓度 1 μ g/mL。LY294002组在PBMC培养液中加入LY294002（终浓度为250 μg/mL）。PDTC组在PBMC培养液中加入PDTC（终浓度为250 μg/mL）。FKN+缬沙坦组在PBMC培养液中加入缬沙坦（终浓度为250 μg/mL），作用2 h后，加入FKN（终浓度为1 μg/mL）。FKN+LY294002组在PBMC培养液中加入LY294002（终浓度为250 μ g/mL），作用2 h后，加入FKN（终浓度为 1 μg/mL）。FKN+PDTC组在PBMC培养液中加入PDTC（终浓度为250 μg/mL），作用2 h后，加入FKN（终浓度为1 μg/mL）。除对照组外，另6组FKN终浓度加至1 μg/mL后，均置于37℃，5%CO2培养箱中孵育。

1.2.2 IL-6检测：收集各组PBMC培养液，在FKN终浓度加至1 μg/mL后在12 h和24 h用ELISA法检测其IL-6表达。严格按IL-6酶联免疫吸附法试剂盒说明书操作。

1.3 统计学方法

本实验数据以x±s表示，采用Bartlett法证明各组方差齐性后，采用方差分析和q检验进行组间两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

处理12 h后：与对照组比较，FKN组IL-6明显降低（P＜0.05），LY294002组和PDTC组无明显差异（P＞0.05）；与FKN组比较，FKN+缬沙坦组IL-6明显降低（P＜0.05），FKN+LY294002组IL-6明显升高（P＜0.05）、FKN+PDTC组IL-6明显降低（P＜0.05）。

处理24 h后各组均无统计学差异（P＞0.05）见表1。

表1 培养12 h和24 h后各组细胞IL-6表达结果（n=3，x±s，pg/ mL）Tab.1 Results of the IL-6 expression in each group after 12hand 24 h of culture（n=3，x±s，pg/mL）

3 讨论

FKN是动脉粥样硬化的危险因素之一［2］。其机制可能为FKN是一种由促炎细胞因子激活、主要表达在内皮和上皮细胞上的跨膜蛋白1，它能够与单个核细胞上的受体CX3CR1结合后介导强烈的细胞黏附作用，这一作用不依赖于整合素。FKN兼具有趋化和黏附的双重作用，参与多种免疫炎性疾病的病理生理过程。Rus等［3］报道IL-6在动脉粥样硬化（AS）壁中的浓度为其血清的200倍，证明了IL-6在AS中的重要性。FKN和IL-6都可影响细胞内炎症因子的表达，但二者相互作用及引发的信号传导机制尚不明确。

以往的研究发现［4］，FKN和IL-6在炎性反应过程中有共同的传导通路ERK1/2，且有研究证实［5］CX3CR1缺失的NK细胞在TLR3激活polyIC时使IL-6增多，而FKN可与受体CX3CR1结合，但二者关系尚不清楚。本研究结果发现，12 h的培养结果显示FKN组IL-6表达明显低于对照组，这个结果与我们预期结果不一致，因为二者均可导致AS的发生及发展，但相互作用是拮抗的，产生这个结果的原因可能如下：其一，细胞因子在高等动物体内的作用方式具有网络调节特点，既可促进又可抑制，我们推测在FKN影响IL-6表达的过程中可能总的效应是抑制；其二，这种总的效应也许会受外界环境等因素的干扰，在一定条件下可能会转换，本实验只是针对健康人外周血单个核细胞，尚需要进一步的研究。

NF-κB是一种诱导性核转录因子，最近研究发现NF-κB的持续激活是有害的，NF-κB可通过调控炎性因子的产生，进而调节白细胞的聚集泡沫细胞形成以及硬化斑块的稳定性，参与AS的发生发展［6，7］。FKN是否可通过NF-κB抑制IL-6，尚不明确。根据12 h后的实验结果显示，NF-κB抑制剂本身对IL-6表达无影响，但NF-κB抑制剂在FKN诱导后，较FKN组IL-6表达明显减少，证实FKN可能通过NF-κB途径促进IL-6的表达。由此可推测，FKN可在某种情况下通过NF-κB途径促进IL-6的表达而影响AS的进展。

P13K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，已有研究表明P13K是许多炎性因子传导的共同通路，且发现P13K可被FKN激活。FKN抑制IL-6表达，PI3K是否参与其中，尚不明确。12 h后的结果显示：同样，PI3K抑制剂本身对IL-6表达无明显影响，但PI3K抑制剂在FKN诱导后，较FKN组IL-6表达明显增多，证实FKN通过PI3K途径可能起抑制IL-6表达作用，阻断PI3K后，IL-6表达明显增多，但较对照组还增高，推测原因可能是FKN还可以通过其他传导通路促进IL-6表达，阻断PI3K后，其他通路如NF-κB途径被激活，FKN通过可通过NF-κB促进IL-6表达，进一步使其表达增加高于对照组。因此，FKN可在PI3K作用下使IL-6表达减少，在AS形成过程中起到拮抗平衡作用。

有研究证实缬沙坦可发挥独立于降压以外的抗炎作用［8］。根据本实验结果，缬沙坦在FKN抑制IL-6表达过程中起协同抑制作用，机制可能是缬沙坦抑制炎性因子的表达，从而进一步使IL-6表达减少。由于本实验样本量较小，尚需要进一步研究证实。

本研究证实FKN可抑制人外周血单个核细胞IL-6的表达，PI3K和NF-κB信号分子可能参与该过程，缬沙坦增加FKN抑制IL-6表达的作用。探索FKN/CX3CR1在细胞内如何影响炎性因子的表达、相互作用及FKN引发的信号传导机制，有助于明确FKN/CX3CR1在一系列病理生理过程中所扮演的角色，提高对免疫炎性因子复杂的错综网络关系的认识，并为治疗相关疾病提供新的切入点。

［1］Yoneda O，Imai T，Goda S，et al.Fractalkine-mediated endothelial cell injury by NK cells［J］.J Immunol，2000，164（8）：4055-4062.

［2］姚康，陆浩，张春瑜，等.急性冠状动脉综合征患者Fractalkine水平的研究［J］.中国介入心脏病学杂志，2012，20（4）：181-184.

［3］Rus H，Niculescu F.Inflammatory response in unstable angina［J］. Circulation，1999，100（19）：e98-e98.

［4］雷明明，孙健，张学颖，等.FKN对外周血单个核细胞ERK1/2活化和TNF-α表达的影响及ERK1/2的临床作用［J］.中国老年学杂志，2011，31（12）：2264-2266.

［5］Yu YR，Fong AM，Combadiere C，et al.Defective antitumor responses in CX3CR1-deficient mice［J］.Inte J Can，2007，121（2）：316-322.

［6］Cuhlmann S，Vander HK，Saliba D，et al.Disturbed blood flow induces RelA expression viac-JunN-terminal kinase1：anovel mode of NFBregulationthat promotes arterial inflammation［J］.Circ Res，2011，108（8）：950-959.

［7］Wang Y，Wang X，Sun M，et al.NF-Bactivity-dependent P-selectin involve in ox-LDL-induced foam cell formation in U937 cell［J］.Biochem Biophys Res Commun，2011，411（3）：543-548.

［8］牛力，孟欣颖，周长宏，等.缬沙坦对高血压伴持续性房颤病人血清炎症因子的影响［J］.中华临床医师杂志，2012，6（9）：6082-6083.

（编辑裘孝琦）

EffectofChemotatic Factor FKN，PI3K and NF-κBon IL-6 Expression in PeripheralBlood Monocytes and the EffectofValsartan Intervention

YUFei，JINYuan-zhe，LEIMing-ming，ZHANGXue-ying，ZHANGXiao-chun，LIUJun
（DepartmentofCardiovascular Medicine，The Fourth Affiliated Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110032，China）

Objective To explore effectofirregularchemotatic factorfractalkine（FKN），phosphatidylinositol3 kinase and nuclearfactor-κB（NF-κB）on interleukin-6（IL-6）expression in peripheral blood monocytes and the effect of valsartan intervention，so as to research the signal conductive mechanism of FKN impacting on IL-6.MethodsPeripheral blood monocytes were isolated from fresh blood of healthy volunteers by the density gradient centrifugation.The extractive peripheral blood monocytes were divided into seven groups：the control group，the FKN group，the LY294002 group（PI3K inhibitors），the PDTC group（NF-κB inhibitors），the FKN+valsartan group，the FKN+LY294002 group，and the FKN+ PDTC group，the latter two were pretreated by LY294002 and PDTC respectively before FKN inducing PBMC cells.The IL-6 expression in cell medium was measured in each group by ELISA at 12 hours and 24 hours after PBMC treatment.ResultsAfter 12 hours of culture，compared with the control group，the expression of IL-6 in the FKN group was decreased（P＜0.05），while LY294002 and PDTC groups had no significant difference（P＞0.05）.Compared with the FKNgroup，the expression ofIL-6 was decreased in the FKN+valsartan group（P＜0.05），increased in the FKN+ LY294002 group（P＜0.05），and was decreased in the FKN+PDTC group（P＜0.05）.After 24 hours of culture，the IL-6 expression in each group had no significant difference（P＞0.05）.ConclusionFKN can adjust the expression of peripheral blood PBMC IL-6 in a two-way pattern，inhibiting the expression of IL-6 by PI3K pathway and promoting the expression of IL-6 by NF-κB pathway，overall，FKN can inhibit the expression ofIL-6.Valsartan can increase FKN to inhibitthe expression ofIL-6.

fractalkine；phosphatidyl inositol 3 kinase；nuclear factor-κB；interleukin-6；valsartan

R541.4

A

0258-4646（2015）03-0214-03

辽宁省科技厅资助项目（2011404013-6）

于霏（1988-），女，硕士研究生.

金元哲，E-mail：jyzzhj@hotmail.com

2014-11-17

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