Eaf2基因调控microRNA抑制白内障发生的机制研究

秦宇，赵江月，罗文婷2，李晶，吴欣蔚，刘佳，阎启昌，张劲松

（1.中国医科大学附属第四医院眼科，中国医科大学眼科医院，辽宁省晶状体学重点实验室，沈阳 110005；2.中国医科大学附属盛京医院实验研究中心，沈阳 110004）

Eaf2基因调控microRNA抑制白内障发生的机制研究

秦宇1，赵江月1，罗文婷2，李晶1，吴欣蔚1，刘佳1，阎启昌1，张劲松1

（1.中国医科大学附属第四医院眼科，中国医科大学眼科医院，辽宁省晶状体学重点实验室，沈阳 110005；2.中国医科大学附属盛京医院实验研究中心，沈阳 110004）

目的探讨Eaf2基因敲除小鼠中microRNA的表达情况，以及Eaf2基因对人晶状体上皮细胞凋亡及晶状体内microRNA表达的影响。方法利用Lipofectamine 2000瞬时转染pEGFP-C1-Eaf2质粒过表达Eaf2基因，利用流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化，利用Real time q-PCR方法检测人晶状体上皮细胞中microRNA的表达情况；利用Real time q-PCR方法检测Eaf2基因敲除小鼠microRNA的表达情况。结果pEGFP-C1-Eaf2质粒转染组细胞凋亡率显著低于对照组，miR-125b、let-7a的表达显著高于对照组，而miR-204的表达显著低于对照组；Eaf2基因敲除小鼠miR-125b、let-7a的表达显著低于对照组，而miR-204的表达显著高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论Eaf2基因可能通过调控microRNA的表达抑制人晶状体上皮细胞凋亡，从而在白内障发生中发挥晶状体保护作用。

Eaf2；microRNA；基因调控；白内障

11-19赖氨酸富集白血病（eleven-nineteen lysine -rich leukemia，ELL）基因相关因子2（ELL-associated factor 2，Eaf2）是一种富含赖氨酸的RNA聚合酶Ⅱ的延伸因子，位于3号染色体长臂3q13.33，编码由260个氨基酸组成的蛋白，可以通过与ELL家族蛋白作用正性调控RNA聚合酶Ⅱ的转录延长。近年来，有关Eaf2基因功能的研究多集中在其抑癌作用的分子机制领域［1］。迄今为止，国内外学者对Eaf2基因在眼部的功能了解甚少。研究发现，Eaf2基因参与紫外线照射引起的DNA损伤修复活动［2］，而紫外线是年龄相关性白内障发生的最重要的危险因素［3］，提示Eaf2蛋白可能作为保护因子参与晶状体细胞的代谢和损伤修复，从而防止或延缓白内障的发生。而晶状体上皮细胞凋亡是除先天性白内障以外其他类型白内障发生的共同细胞学基础［4］，推测Eaf2可能参与调控晶状体上皮细胞凋亡的过程。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是近年发现的一种小分子非编码RNA，它可以通过调节RNA半衰期或者与3′UTR区结合抑制靶基因翻译，从而在转录后水平影响发育、增殖、分化、凋亡等过程中组织特异性基因的表达［5～7］。microRNA作为转录因子重要的靶分子在细胞功能调控中发挥核心作用。已有研究证实，microRNA与细胞凋亡密切相关［8～10］。因此，推测Eaf2基因可能通过调控microRNA的表达影响晶状体细胞凋亡等生物学过程，最终作为保护因子，干预或延缓白内障的发生。

前期研究证实，miR-125b通过直接抑制靶基因p53的表达调控人晶状体上皮细胞凋亡［11］。利用生物信息学预测软件TargetScan 5.2，Diana-micro T和miRanda共同预测得出，miR-204可能靶向调控B淋巴细胞瘤/白血病2（bcl-2）基因，let-7a可能靶向调控天冬氨酸特异性的半胱氨酸酶3（caspase-3）基因，而bcl-2基因和caspase-3基因在线粒体通路这一最主要的凋亡通路中发挥重要作用，提示miR-204、let-7a可能与凋亡密切相关。因此，本研究选择了miR-125b、miR-204和let-7a这3种microRNA作为研究对象。

本研究利用Eaf2基因敲除小鼠及pEGFP-C1-Eaf2质粒，通过转染、流式细胞技术、Real time q-PCR等方法，进行了离体及在体实验，探讨Eaf2基因敲除小鼠中microRNA的表达情况，以及Eaf2基因对人晶状体上皮细胞凋亡的影响及晶状体内microRNA的调控作用，进一步探讨Eaf2基因在白内障发生中是否具有晶状体保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：人晶状体上皮细胞系（SRA01/04）由美国Doheny眼科研究所Dr.Yi-sin Liu惠赠。

1.1.2 实验动物：Eaf2基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠由美国Doheny眼科研究所Dr.Yi-sin Liu惠赠。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染：SRA01/04细胞利用DMEM培养基（含10%新生牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素），置于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。将SRA01/04细胞于转染前24 h接种于6孔细胞培养板中，使转染时细胞密度达到30%～50%。利用Lipofectamine 2000（Invitrogen公司，美国）将pEGFP-C1-Eaf2质粒和pEGFP-C1质粒分别转染至SRA01/04细胞中，转染后48 h进行相关检测。

1.2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡率：利用细胞凋亡PI染色试剂盒（KenGEN公司，中国），用1×Buffer A洗涤细胞1次（离心2 000 r/min，5 min），收集并调整细胞浓度为1×106/mL；细胞加9倍体积的70%乙醇，于-20℃固定至少12 h；离心收集细胞后，用1×Buffer A洗细胞除去乙醇，细胞重悬于500 μL Buffer A中；加入RNase A，使其终浓度为0.25 mg/mL，37℃反应30 min；加入5 μL PI，室温避光染色30 min；流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.3 实验动物标本制备：将Eaf2基因敲除小鼠（Eaf2-/-）和C57BL/6小鼠交配，子代小鼠留取鼠尾提取DNA，PCR鉴定基因型。选取Eaf2杂合子小鼠（Eaf2+/-）相互交配，子代小鼠留取鼠尾提取DNA，PCR鉴定基因型。选取基因型为Eaf2-/-的小鼠作为实验组，同窝基因型为Eaf2+/+的小鼠作为对照组。乙醚麻醉小鼠，断颈处死，显微镜下解剖，取眼球晶状体，DEPC-PBS冲洗1～2次，备后续实验使用。

1.2.4 Real time q-PCR检测microRNA的表达：利用Trizol®Reagent（Invitrogen公司，美国）提取总RNA，PrimerScriptTMRT Enzyme Mix（Takara公司，日本）逆转录为cDNA。利用SYBR Premix Ex TaqⅡ（Takara公司，日本）检测microRNA的表达量，RNU6B为内参对照。miR-125b、miR-204和let-7a的RT引物、特异性上游引物和通用下游引物由Ribobio公司合成。利用ABI 7500（Applied Biosystems公司，美国）进行反应，反应体系为20 μL，反应条件为95℃30 s；95℃5 s，60℃34 s，40个循环；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。经过3次独立实验后得到的数据，利用公式RQ=2-ΔΔCt进行分析。

1.3 统计学分析

应用SPSS 16.0统计学软件，采用独立样本t检验进行分析，数据以x±s表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Eaf2基因抑制人晶状体上皮细胞凋亡

向SRA01/04细胞中分别转染pEGFP-C1-Eaf2质粒和pEGFP-C1质粒，转染后48 h，利用流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。结果显示：pEGFP-C1-Eaf2质粒转染组细胞凋亡率显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），见图1。提示Eaf2基因可能抑制人晶状体上皮细胞凋亡。

图1 Eaf2基因对人晶状体上皮细胞凋亡的调控Fig.1 The effect of Eaf2on apoptosis of human lens epithelial cells

2.2 Eaf2基因调控晶状体内microRNA的表达

向SRA01/04细胞中分别转染pEGFP-C1-Eaf2质粒和pEGFP-C1质粒，转染后48 h，利用Real time q-PCR方法检测microRNA的表达情况，RNU6B作为内参对照。结果显示：pEGFP-C1-Eaf2质粒转染组miR-125b、let-7a的表达显著高于对照组（P＜0.01），而miR-204的表达显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），见图2。

图2 Eaf2基因对晶状体内microRNA表达的调控Fig.2 The effect of Eaf2on the expression of microRNA in lens

2.3 Eaf2基因敲除小鼠microRNA的表达

利用Real time q-PCR方法，检测基因型为Eaf2-/-的小鼠和同窝基因型为Eaf2+/+的小鼠microRNA的表达情况，RNU6B作为内参对照。结果显示：Eaf2-/-组miR-125b、let-7a的表达显著低于对照组（P＜0.01），而miR-204的表达显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），见图3。

3 讨论

图3 Eaf2基因敲除小鼠microRNA的表达Fig.3 The expression of microRNA in Eaf2 knockout mice

Eaf2基因最早因其调控胚胎发育及在前列腺中对雄激素的应答而被发现。有关Eaf2基因功能的研究，国内外学者多集中在其抑癌作用的分子机制领域，例如，在前列腺癌发病分子机制领域及对胚胎发育的影响等方面［1］。Eaf2作为ELL因子的结合蛋白发挥抑癌作用，同时ELL与p53也可以结合。Su等［12］在肝癌和前列腺癌组织中发现Eaf2与p53结合后可以调控血小板凝血酶致敏蛋白1（thrombospondin-1，TSP-1）启动子的活性，从而抑制肿瘤血管的生成，证实了Eaf2与p53之间的伴侣和调控关系。而p53具有诱导microRNA转录、促进特异的microRNA成熟，通过调控microRNA影响细胞增殖、分化等的功能［13］。p53在晶状体内大量表达，且表达位置与Eaf2一致［14］。提示Eaf2可能参与对细胞凋亡的调控。

然而，目前有关Eaf2基因在眼部的功能方面的研究较少。研究证实，Eaf2基因在发育中的晶状体赤道部上皮细胞、分化的晶状体纤维细胞及神经视网膜中大量表达，对眼球发育起重要的调节作用［15］。另有研究发现，Eaf2基因参与紫外线照射引起的DNA损伤修复活动［2］，而紫外线是年龄相关性白内障发生的最重要的危险因素［3］，紫外线照射后可以损伤晶状体上皮细胞间缝隙连接蛋白（Cx），影响细胞间信息传递，是白内障发生的机制之一［16］，人类或者动物受到紫外线急性辐射损伤或低剂量照射累积均可以导致白内障［17］。因而我们推测Eaf2基因在白内障的发生中可能发挥一定的作用。

microRNA是长约21～25个核苷酸的一类单链内源性小分子非编码RNA［18］，在不同组织中表达具有特异性，在转录后水平对靶基因进行负向调控。单个microRNA可以作用于多个靶基因，而多个microRNA可以作用于同一靶基因，由此形成了microRNA复杂的调控网络。人类整个基因组中，约1/3的编码蛋白基因受其调控［19］。microRNA的出现改变了以往对非编码RNA的认知。microRNA参与生命过程中包括发育、细胞增殖、凋亡等一系列重要的活动［8～11］，它与疾病的关系日益引起人们关注。研究证实，microRNA与多种疾病，包括眼部疾病的发生和发展有密切的联系［20～22］。随着新的生物信息学方法和技术的产生，microRNA成为基因诊断和治疗的新热点。

本研究结果发现：向SRA01/04细胞中转染pEGFP-C1-Eaf2质粒，使Eaf2基因过表达，细胞凋亡率显著降低，提示Eaf2基因可能抑制人晶状体上皮细胞凋亡。Eaf2基因过表达使miR-125b、let-7a的表达显著升高，miR-204的表达显著降低。而体内实验中，Eaf2基因敲除小鼠miR-125b、let-7a的表达显著降低，miR-204的表达显著升高。

综上所述，强烈提示Eaf2这种转录因子可能通过调控microRNA的表达影响晶状体细胞凋亡，作为保护因子干预或防止白内障的发生。Eaf2基因很有可能是影响白内障发生的关键基因，明确其在晶状体内的调控功能可能会从分子水平揭示白内障发病的关键环节，值得进一步深入研究。

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（编辑王又冬）

Mechanism of Eaf2Gene Regulating microRNA in Inhibiting the GenesisofCataract

QINYu1，ZHAOJiang-yue1，LUOWen-ting2，LIJing1，WUXin-wei1，LIUJia1，YANQi-chang1，ZHANGJin-song1
（1.Department of Ophthalmology，The Fourth Affiliated Hospital，China Medical University，Eye Hospital of China Medical University，Key Lens Research Laboratory of Liaoning Province，Shenyang 110005，China；2.Key Laboratory of Health Ministry for Congenital Malformation，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo explore the expression ofmicroRNAin Eaf2knockoutmice and the effectof Eaf2on the apoptosis ofhuman lens epithelial cells and the expression of microRNA in lens.MethodspEGFP-C1-Eaf2 was transfected into SRA01/04 cells using Lipofectamine 2000 to over express Eaf2gene，and then the flow cytometry was used to detect cell apoptosis rate.And real time q-PCR was used to measure the expression of microRNA both in human lens epithelial cells and Eaf2 knockout mice.ResultsCompared with controls，the apoptosis rate of cells transfected with pEGFP-C1-Eaf2 was reduced，the expression ofmiR-125b and let-7a wassignificantly increased and miR-204 wasdecreased in cells transfected with pEGFP-C1-Eaf2.Compared with controls，the expression of miR-125b and let-7a was lower and miR-204 was higher in Eaf2knockout mice.Each result was statistically significant（P＜0.01）.ConclusionEaf2might inhibit apoptosis of human lens epithelial cells via regulating the expression ofmicroRNA.Eaf2 may have a protective effectforthe lensin the genesisofcataract.

Eaf2；microRNA；gene regulation；cataract

R776.1

A

0258-4646（2015）03-0199-04

国家自然科学基金（81270988）；辽宁省教育厅科学技术研究一般项目（L2014305）；中国医科大学附属第四医院青年创新发展基金项目（YB1217）

秦宇（1982-），女，讲师，博士.

张劲松，E-mail：zhangjs0331@126.com

2014-12-23

网络出版时间：