瘤胃纤毛虫的壳多糖酶

（青岛科技大学化工学院，山东青岛266042）

1 介绍

瘤胃中的原虫能迅速吞没真菌孢子，这些孢子在角素中大量存在[1]。我们还发现，纤毛虫能消化和发酵角素[2]。但是，一些种类的瘤胃原虫的有关壳多糖酶信息还不完全。本研究的目的是将纤毛虫的这些壳聚糖酶进行识别和特征描述。

2 材料和方法

Dogiel[3]识别出了纤毛虫E.maggii,它们是从天然绵羊种群的瘤胃中分离出来。这些纤毛虫根据Michslowski等[4]提出的方法在体外培养，然后被注射到没有纤毛虫的绵羊的瘤胃中[5]。生活在单一动物区系的绵羊的瘤胃中的纤毛虫会继续它们的酶工作。液体样品取自瘤胃，其中的原虫被分离出来并经离心纯化[6]。纯化后的纤毛虫在抗生素混合物（氯霉素、链霉素、氨苄青霉素）中进行过夜孵化，每种物质的浓度为50μg/mL。使用抗生素的目的是为了限制细胞内细菌的生长。孵化后，用温热的盐水（40℃）对纤毛虫清洗三次[7]。最后，对它们进行离心法浓缩并在-80℃下储存。为了制备酶制剂，我们将冰冻的纤毛虫融化并放在一个含有研棒的高速搅拌器中进行均化。所得的均化物经过离心（22,000×g，30min，4℃）处理，将浮在表面的物质收集起来作为粗酶制剂。在粗酶中孵化出来的羧甲基角素会产生糖[8]，内壳多糖酶的活性是由羧甲基角素释放的这些糖减少的数量来确定的。反应混合物包含0.4mL培养基、0.4mL酶制剂和0.2mL的0.1mol/L的柠檬酸盐—硫酸盐缓冲液。混合物于40℃下孵化1min，所释放的物质根据Miller等[9]提出的方法用光谱光度测量法进行检测。外壳多糖酶和β-N-乙酰基葡萄糖苷酶的活性是通过测量硝基苯的数量来确定的，这些硝基苯是由粗酶制剂分别作用于对4-硝基-N,N-二乙酰基-D-壳二糖和4-硝基苯-β-N-乙酰基氨基葡萄糖苷而产生的。反应混合物包括浓度为1μmol/L的培养基溶液100μL，50μL酶制剂和150μL 0.1mol/L的柠檬酸盐-硫酸盐缓冲液。混合物于40℃下孵化1h，根据Yem和Wu[10]提出的方法进行定量测量。对粗酶制剂进行聚丙烯酰胺电泳（PAGE），再加上酶谱分析，可以识别出角素降解酶[8]。羧甲基-角素，4-甲基香豆素-β-D-N,N-二乙酰基壳二糖和4-甲基香豆素-N-乙酰基-β-氨基葡萄糖作为特定物质加入到培养基中，用于分离凝胶以识别内壳多糖酶，外壳多糖酶和β-N-乙酰基葡萄糖苷酶。

表1 E.maggii壳多糖酶的特性

3 结果和讨论

我们的研究表明E.maggii纤毛虫拥有内壳多糖酶，外壳多糖酶和β-N-乙酰基葡萄糖苷酶，是这些酶催化角素降解得到的。这个发现支持了关于壳多糖性质的早期研究结果[11]。他们的结果也表明最具活性的是β-N-乙酰基葡萄糖苷酶。其活性是Williams等[12]在E.mggii中发现的类似的酶的活性的12倍。内壳多糖酶和外壳多糖酶的活性相似（p＞0.05）,它们大约只有β-N-乙酰基葡萄糖苷酶的活性的一半（见表1）。

图1 根据酶谱技术识别出的瘤胃纤毛虫E.maggii的壳多糖酶；用PAGE法分离出原虫蛋白质。

总之，六个蛋白质带展示了它们对角素的降解能力或者说是它们的降解物数量（图1）。两个是来自内壳多糖酶，两个来自外壳多糖酶，还有两个来自β-N-乙酰基葡萄糖苷酶。

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