多肽复配组合物对皮肤结构相关效应蛋白促进表达协同增效的研究

本研究评估了两种多肽——乙酰基二肽-1鲸蜡酯，乙酰基四肽-2，和一种提取物——假交替单胞菌发酵产物提取物对皮肤相关结构蛋白的协同增效促进作用，发现三者联合给药能够显著增加皮肤抗衰老相关蛋白的表达，获得稳定、显著的抗衰老效果。本研究评价了5μg/mL乙酰基二肽-1鲸蜡酯、5μg/mL乙酰基四肽-2、5μg/mL假交替单胞菌发酵产物提取物单独或联合应用于HFF-1细胞，对Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、LOXL-1、Col-I等胶原蛋白和弹性蛋白相关mRNA分子的影响。采用5μg/mL乙酰基二肽-1鲸蜡酯+5μg/mL乙酰基四肽-2+5μg/mL假交替单胞菌发酵产物提取物联合进行细胞给药，与5μg/mL乙酰基二肽-1鲸蜡酯、5μg/mL乙酰基四肽-2、5μg/mL假交替单胞菌发酵产物提取物单独给药相比，联合给药能协同促进HFF-1细胞中Col-I、LOXL-1，Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、TGF-β的mRNA的表达（p<0.05）。因此，乙酰基二肽-1鲸蜡酯，乙酰基四肽-2，假交替单胞菌发酵产物的联合应用，具有更好的协同增效的抗衰老活性，具备在化妆品产品中少量添加就能达到更好效果的应用前景。

皮肤中存在众多的ECM（extracellular matrix，细胞外基质）蛋白，其中胶原蛋白、弹性蛋白是最重要的两种[1，2]，它们在皮肤抗衰老中起着非常重要的作用。除了胶原蛋白和弹性蛋白，还有非常多的结构蛋白，结构辅助蛋白[8，9，10]。在这些结构辅助蛋白里，LOXL-1是一种很重要的细胞外依赖铜的胺氧化酶[6，7]，催化胶原蛋白和弹性蛋白中交叉链接形成的第一步，其表达量的增加能更好地促进胶原蛋白和弹性蛋白纤维的生成[13-15]。

弹性蛋白是弹性纤维（elasticfibers）的主要成分。弹性纤维主要存在于韧带和脉管壁。弹性纤维与胶原纤维共同存在，赋予组织以弹性和抗张能力。尽管弹性蛋白只占真皮总蛋白的2%，但它对皮肤弹性起着重要作用[16-19]。

乙酰基二肽-1鲸蜡酯，乙酰基四肽-2，假交替单胞菌发酵产物提取物都是各大化妆品公司经常使用的核心原料，原料供应商提供的之前的研究资料表明，乙酰基二肽-1鲸蜡酯能有效促进弹力蛋白的再生，注重弹性纤维的修复，为肌肤打造一层健康、紧致的纤维网络，抑制表情纹。它同时被称作肌肤的“弹力素”，可支撑松垮的皮肤，提供紧致上扬的弹力。乙酰基四肽-2可以上调与胶原蛋白合成和黏着斑有关的基因表达，诱导弹性蛋白、I型胶原蛋白合成，从而增加皮肤紧实度。假交替单胞菌发酵产物提取物具有促进成纤维细胞增殖，诱导I型，IV型胶原蛋白和弹性蛋白合成，提高皮肤屏障功能，减少炎性基因表达，抑制脂质过氧化等诸多功效，然而对这三者进行的单独和联合的功效比较测试还未有研究，此次研究就评估了三个原料的联合对皮肤相关结构蛋白的协同增效促进作用。

材料和方法

01试剂与仪器

DMEM培养基（20210121/20210406，Cellmax），血清（2132094P，Gibco），胰酶（20210113/20210323，碧云天），双抗（20200828，北京索莱宝科技有限公司），TRIzon（03877/35120，康为世纪），三氯甲烷（20200105，国药化学试剂），HiFiScriptcDNASynthesisKit（100rxns34520，康为世纪），UltraSYBR（31420，康为世纪），噻唑蓝（MTT，Sigma-Aldrich公司，M2128-100MG），HFF-1人皮肤成纤维样细胞（中国科学院典型培养物保藏委员会上海细胞库，培养条件：5% CO2，37℃恒温培养箱，培养基：89% DMEM+10%FBS+1%双抗），乙酰基二肽-1鲸蜡酯（1453629，Sederma），乙酰基四肽-2（U19B013-20，Lipotec），假交替單胞菌发酵产物提取物（U07K010-19，Lipotec），生物显微镜（LWD300-38LT，上海测维光电技术有限公司），恒温水浴锅（HH-1嘉兴俊思电子有限公司），高速冷冻离心机（SorvallLegendMicro17R，Thermo），CO2培养箱（BB150，Thermo），纯水仪（Smart-DUF，上海和泰仪器有限公司），多功能酶标仪（SpectraMaxiD3，MolecularDevices）。

02测试方法

2.1细胞毒性测试

取指数生长期的细胞制成单细胞悬液，以1×104cells/mL的密度接种于96孔板上，用含10%胎牛血清的培养基37℃培养24h使细胞贴壁，培养终体积为0.2mL，而后吸弃上清，加入新鲜制备的不同浓度的药物（无血清）或者不加药物（无血清）孵育，培养终体积为0.2mL。24h后，显微镜下观察细胞毒性情况。MTT法检测细胞毒性，于490nm测定吸光度，计算细胞活率。细胞活率=ASample/AControl×100%。

2.2 qPCR检测

取指数生长期的细胞制成单细胞悬液，以1×105cells/mL的密度接种于6孔板上，用含10%胎牛血清的培养基37℃培养24h使细胞贴壁，培养终体积为2mL。而后吸弃上清，加入新鲜制备的不同浓度的药物（无血清）或者不加药物（无血清）孵育，培养终体积为2mL。24h后，按RNA提取标准操作流程提取各孔RNA，qPCR法检测HFF-1细胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、Col-XVII、Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、Decorin、LOXL-1、TGF-β、IntegrinmRNA的表达影响。

2.3受试物的配制方法

受试物和对照品用DMSO或者ddH2O配制成母液，再用无血清培养基或者PBS稀释至合适浓度。

2.4分组与给药（表1）

2.5指标检测

细胞给药后提取总RNA，qPCR，检测HFF-1细胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、Col-XVII、Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、Decorin、LOXL-1、TGF-β、IntegrinmRNA的表达影响。

2.6数据录入和统计分析

采用Excel录入和GraphPadPrism7软件包统计处理，以均数±标准误表示。各组间做单因素方差分析（ANOVA）。认为p<0.05有统计学差异。

结果

01受试物对HFF-1细胞毒性的影响

分别用0.1、0.5、1、5、10、20、40μg/mL乙酰基二肽-1鲸蜡酯，乙酰基四肽-2，假交替单胞菌发酵产物提取物，或乙酰基二肽-1鲸蜡酯：乙酰基四肽-2：假交替单胞菌发酵产物提取物质量比为1：1：1联合给药，MTT法评估细胞毒性，结果如图1所示，由图1可知，乙酰基二肽-1鲸蜡酯在20ug/mL下都没有细胞毒性，乙酰基四肽-2在40ug/mL都没有毒性，假交替单胞菌发酵产物提取物在40ug/mL下都没有细胞毒性，乙酰基二肽-1鲸蜡酯，乙酰基四肽-2，假交替单胞菌发酵产物提取物三者1：1：1联合给药，在20ug/mL下非但没有细胞毒性，而且还能促进细胞增殖。

乙酰基二肽-1鲸蜡酯，乙酰基四肽-2，假交替单胞菌发酵产物提取物单独或联合给药24h对HFF-1细胞增殖的影响。n=3，Mean±SEM。“***”表示与对照组相比p<0.001。

02受试物对HFF-1细胞胶原蛋白相关基因表达的影响

本研究选取5μg/mL乙酰基二肽-1鲸蜡酯、5μg/mL乙酰基四肽-2、5μg/mL假交替单胞菌发酵产物提取物单独或联合对HFF-1细胞孵育24h，提取细胞总RNA后，qPCR检测胶原蛋白相关mRNA的表达，结果如图2所示。5μg/mL乙酰基二肽-1鲸蜡酯、5μg/mL乙酰基四肽-2、5μg/mL假交替单胞菌发酵产物提取物单独给药能促进COL-I，COL-III，COL-IV，LOXL-1的表达，与单独给药相比，5μg/mL乙酰基二肽-1鲸蜡酯、5μg/mL乙酰基四肽-2、5μg/mL假交替单胞菌发酵产物提取物联合给药，协同增加HFF-1细胞Col-I、LOXL-1mRNA的表达（p<0.05）。

乙酰基二肽-1鲸蜡酯、乙酰基四肽-2、假交替单胞菌发酵产物提取物单独或联合给药24h对HFF-1细胞胶原蛋白相关基因mRNA表达的影响。n=3，Mean±SEM。“*”表示与联合给药组相比p<0.05，“**”表示与联合给药组相比p<0.01，“***”表示与联合给药组相比p<0.001。

03受试物对HFF-1细胞弹性蛋白相关基因表达的影响

5μg/mL乙酰基二肽-1鯨蜡酯、5μg/mL乙酰基四肽-2、5μg/mL假交替单胞菌发酵产物提取物单独或1：1：1联合对HFF-1细胞孵育24h，提取细胞总RNA后，qPCR检测弹性蛋白相关mRNA的表达，结果如图3所示。5μg/mL乙酰基二肽-1鲸蜡酯、5μg/mL乙酰基四肽-2、5μg/mL假交替单胞菌发酵产物提取物单独给药能促进Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、TGF-β、Integrin的mRNA表达，与单独给药相比，5μg/mL乙酰基二肽-1鲸蜡酯、5μg/mL乙酰基四肽-2、5μg/mL假交替单胞菌发酵产物提取物联合给药协同增加HFF-1细胞Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、TGF-βmRNA的表达（p<0.05）。

乙酰基二肽-1鲸蜡酯，乙酰基四肽-2，假交替单胞菌发酵产物提取物单独或联合处理24h对HFF-1细胞相关mRNA表达的影响。n=3，Mean±SEM。“*”表示与联合给药组相比p<0.05，“**”表示与联合给药组相比p<0.01，“***”表示与联合给药组相比p<0.001。

小结与讨论

化妆品中的生物多肽类化合物具有高生物活性、易吸收、安全无毒的独特优势。近年来其在美容护肤、抗衰老研究课题中的生理作用与生物效应逐渐引发关注[3，4，11，12];多肽的生物学活性取决于其氨基酸组成和序列，人体内各种生理进程几乎都是由特定的氨基酸序列组成的多肽或者蛋白质调控的。因此，生物活性肽为化妆品研发和应用提供了全新方向和思路，并且功能越来越细分，如抗衰老、抗过敏、修复、抗氧化、抗水肿、促进毛发再生、抑制黑色素生成等。添加多肽到化妆品中能够帮助改善、修复皮肤的各种问题，但目前单种多肽活性物质应用报道较多，而多种多肽和活性物的组合应用研究开发较少[5]，特别是多种不同类型的肽类和活性物组合针对抗衰老的靶点协同增效作用报道较少。本研究中的多肽提取物组合协同增效结果，在活性物组合的研究中，具备较强的创新性。在本研究中，我们采用乙酰基二肽-1鲸蜡酯、乙酰基四肽-2、假交替单胞菌发酵产物提取物联合给药，发现协同给药能协同促进HFF-1细胞Col-I、LOXL-1、Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5mRNA的表达，获得更强、更显著的抗衰老效果。

综上所述，本研究采用乙酰基二肽-1鲸蜡酯、乙酰基四肽-2和假交替单胞菌发酵产物提取物三种活性组份，针对抗衰老的靶点进行协同增效作用，能够显著地增加对抗衰老相关的重要蛋白的表达。因而，本研究中的抗衰老组合物、乙酰基二肽-1鲸蜡酯、乙酰基四肽-2、假交替单胞菌发酵产物的联合应用，具有更好的协同增效的抗衰老活性，因为联合作用功效增强了，在同等的功效下，联合作用原料可以用量更小，所以这样的组合具备在化妆品产品中少量添加就能达到更好效果的应用前景。

作者介绍：洪民华，供职于懿奈（上海）生物科技有限公司。